karbohidrat

I. Prinsip
Penggolongan Karbohidrat (monosakarida, disakarida, polisakarida, ketosa, dll) berdasarkan reaksi-reaksi umum untuk karbohidat.

II. Tujuan Percobaan
a. Mengetahui cara-cara identifikasi golongan-golongan karbohidrat.
b. Mengetahui proses glikolisis dan hidrolisis pada bahan yang mengandung karbohidrat.

III. Teori Dasar
Karbohidrat tersebar luas baik dalam jaringan hewan maupun jaringan tumbuh-tumbuhan. Dalam tumbuh-tumbuhan, karbohidrat dihasilkan oleh fotosintesis dan mencakup selulosa serta pati. Pada jaringan hewan, karbohidrat dalam bentuk glukosa dan glikogen.
Karbohidrat adalah polihidroksildehida dan keton polihidroksil atau turunannya. selain itu, ia juga disusun oleh dua sampai delapan monosakarida yang dirujuk sebagai oligosakarida. Karbohidrat mempunyai rumus umum Cn(H2O)n. Rumus itu membuat para ahli kimia zaman dahulu menganggap karbohidrat adalah hidrat dari karbon. Pada umumnya karbohidrat merupakan zat padat berwarna putih yang sukar larut dalam pelarut organik tetapi larut dalam air (kecuali beberapa polisakarida).
Karbohidrat dibagi dalam 4 golongan yaitu : monosakarida, disakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Monosakarida adalah karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis menjadi bentuk yang lebih sederhana. Monosakarida dapat dibedakan berdasarkan banyaknya atom C pada molekulnya, misalnya triosa dengan 3 atom C; tetrosa dengan 4 atom C; pentosa dengan 5 atom C; heksosa dengan 6 atom C dan heptosa sengan 7 atom C. Selain itu dibedakan atas gugus aldehid atau gugus keton yang dikandungnya menjadi aldosa dan ketosa.
• Monosakarida meliputi glukosa, galaktosa, manosa, fruktosa, dan lain sebagainya.
• Disakarida adalah senyawa yang dapat dihidrolisis menjadi 2 molekul monosakarida.
• Oligosakarida adalah karbohidrat yang dapat diuraikan menjadi 2 sampai 10 molekul monosakarida.
• Polisakarida merupakan polimer yang tetrdiri atas unit-unit monosakarida dan bila dihidrolisis menghasilkan lebih dari 6 molekul monosakarida. Glikogen dan amilum merupakan polimer glukosa.
• Pati / Amilum
Yang terdapat dalam alam tidak larut dalam air dan memberikan warna biru dengan iodium. Hasil hidrolisis pati/amilum adalah glukosa. Hidrolisis pati akan terjadi pada pemanasan dengan asam encer dimana berturut-turut akan dibentuk amilodeksterin yang memberi warna biru dengan iodium, eritrodekstrin yang memberi warna merah dengan iodium serta berturut-turut akan dibentuk akroodekstrin, maltosa, dan glukosa yang tida memberi warna dengan iodium.
• Glikogen
Terdapat pada hewan, molekulnya lebih kecil daripada amilum. Glikogen tidak mereduksi larutan Benedict dan dengan iodium memberikan warna merah.

Uji Karbohidrat:

1. Uji Molisch
Uji Molisch adalah uji umum untuk karbohidrat. Pereaksi molisch yang terdiri dari α-naftol dalam alkohol akan bereaksi dengan furfural tersebut membentuk senyawa kompleks berwarna ungu yang disebabkan oleh daya dehidrasi asam sulfat pekat terhadap karbohidrat. Uji ini bukan uji spesifik untuk karbohidrat, walalupun hasil reaksi yang negatif menunjukkan bahwa larutan yang diperiksa tidak mengandung karbohidrat. Terbentuknya cincin ungu menyatakan reaksi positif.

2. Uji Benedict
Larutan tembaga alkalis akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas dengan membentuk kuprooksida yang berwarna. Gula pereduksi beraksi dengan pereaksi menghasilkan endapan merah bata (Cu2O). Pada gula pereduksi terdapat gugus aldehid dan OH laktol. OH laktol adalah OH yang terikat pada atom C pertama yang menentukan karbohidrat sebagai gula pereduksi atau bukan.

3. Uji Barfoed
Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida. Pada percobaan ini, karbohidrat direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis.

4. Uji Seliwanoff
Reaksi ini spesifik untuk ketosa. Dasarnya adalah perubahan fruktosa oleh asam panas menjadi levulinat dan hidroksimetilfurfural yang selanjutnya berkondensasi dengan resorsinol membentuk senyawa berwarna merah.

5. Uji Tollens
Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan heksosa.

6. Hidrolisis Sukrosa
Sukrosa adalah karbohidrat golongan disakarida. Hidrolisis sukrosa ini untuk membuktikan apakah hasil hidrolisis dari sukrosa adalah glukosa dan fruktosa yaitu dengan cara setelah sukrosa dihidrolisis, larutan yang telah dihidrolisis itu dites dengan test benedict untuk membuktikan glukosa dan test seliwanoff untuk membuktikan ada fruktosa.

7. Percobaan glikolisis pada ragi
Pada manusia dan hewan, hasil akhir glikolisis anaerob adalah asam laktat, sedangkan pada ragi glikolisis anaerob (peragian gula) menghasilkan etanol.
Pada percobaan ini akan dilihat hasil glikolisis anaerob pada ragi yang berupa CO2 dan etanol. Selain itu akan dilihat pula pengaruh inhibitor terhadap glikolisis anaerob.

8. Pembuatan pati ( amilum ) dari kentang

9. Hidrolisis Pati
Pada percobaan ini akan terlihat bahwa pada hidrolisis pati ini glukosa akan terbentuk sebagai zat akhir. Penambahan HCl pekat lalu pemanasan dimaksudkan agar hidrolisis terjadi karena hidrolisis pati hanya terjadi dalam pemanasan dengan asam.

10. Glikogen

IV. Alat dan Bahan
Alat :
- Tabung reaksi
- Pipet tetes
- Erlenmyer
- Penangas air
- Corong Buchner
- Cawan porselen
- Tabung peragian
- Blender
- Pengaduk
- Termometer
- Beaker glass
- Pembakar spiritus

Bahan :
- Glukosa 1%
- Fruktosa 1%
- Laktosa 1%
- Sukrosa 1%
- Amilum 1%
- Arabinosa 1 %
- Gummi arabicum
- NaCl 1%
- Hati sapi
- H2SO4 pekat
- Galaktosa 1%
- Larutan Benedict
- Larutan Barfoed
- Larutan pereaksi Seliwanoff
- Alkohol 1%
- Aquadest
- Pereaksi Molisch
- Pereaksi Tollens
- Ragi
- Kentang
- Hati
- Larutan Lugol
- HCl pekat
- NaOH 2N

V. Prosedur Percobaan
1. Test Molisch
2 mL larutan yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam tabung reaksi, tambahakan 2 tetes pereaksi Molisch, campur dengan baik, kemudian dengan hati-hati dan perlahan taqmbahkan melalui dinding tabung 2mL asam sulfat pekat.
Lakukan tes terhadap larutan 1% glukosa, galaktosa, laktosa, dan sukrosa.

2. Test Benedict
Larutan tembaga alkalis akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas dengankuprooksida berwarna.
2.5 mL larutan Benedict dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 4 tetes larutan yang akan diperiksa. Campur dan tempatkan semua tabung di dalam penangas air mendidih selama lima menit. Dinginkan perlahan-lahan dan perhatikan apakah terbebtuk endapan dan bagaimana warna endapan tersebut.
Lakukan percobaan ini dengan menggunakan larutan 1% glukosa, fruktosa, laktosa, sukrosa dan amilum.

3. Test Barfoed
Masukkan ke dalam tabung reaksi 1 mL larutan Barfoed dan 1 mL larutan yang akan diperiksa. Panaskan dalam penangas air mendidih selama satu menit atau lebih, sampai terlihat adanya reduksi.
Lakukan percobaan ini dengan larutan 1% glukosa, galaktosa, laktosa dan sukrosa.

4. Test Seliwanoff
Masukkan 0,5 mL larutan yang akan diperiksa ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 5 mL pereaksi Seliwanoff, campur dan letakkan tabung di dalam penangas air mendidih selama 60 detik, dan perhatikan warna yang terbentuk.
Percobaan dilakukan menggunakan larutan 1% glukosa, fruktosa dan sukrosa.

5. Reaksi Tollens
2 mL pereaksi dipanaskan dengan 5 tetes larutan yang akan diperiksa dalam penangas air mendidih. Reaksi positif bila timbul warna merah anggur.
Percobaan dilakukan menggunakan larutan 1% Arabinosa, glukosa dan gummi arabikum.

6. Hidrolisis sukrosa
Masukkan 10 mL larutan sukrosa ditambah dengan 10 tetes HCL(pekat) panaskan dalam waterbath 45 menit, dingingkan, tambahkan aquadest 50 ml. Larutan diuji dengan uji benedict dan seliwanoff.

7. Percobaan glikolisis pada ragi
Sediakan 4 buah cawan porselen yang bersih dan 4 buah tabung peragian. Masukkan ke dalam masing-masing cawan porselen bahan-bahan sebagai berikut:

Cawan 1 2 3 4
Ragi 1 g 1 g 1 g 1 g
Akuadest 14 mL 14 mL
100° C 13.5 mL 13,5 mL
.
Gerus/campur ragi dalam akuades dengan menggunakan ujung tabung reaksi sehingga diperoleh suspensi yang rata, kemudian masukkan:

Larutan glukosa 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Larutan flourida - - 0,5 mL -
Larutan arsenat - - - 0,5 mL

Aduk campuran tersebut baik-baik, kemudian tuangkan ke dalam tabung peragian sehingga kedua ujung tertutupnya dipenuhi suspensi ragi. Kembalikan tabung pada kedudukan normal, lengan panjang harus tetap terisi. Biarkan selama tepat 30 menit. Apabila telah ada gas yang terbentuk, ke dalam tabung ditambahkan NaOH encer sehingga memenuhi ujung tabung terbuka. Tutup ujung yang terbuka dengan ibu jari.

8. Pembuatan pati (amilum) dari kentang
150 gr kentang dikupas dan dicuci. Dipotong-potong kemudian dihomogenkan dengan menggunakan kain dan cairan ditampung dalam gelas ukur 500 mL, residu dibuang. Tambahkan 200 mL air, kocok dan biarkan campuran mengendap. Cairan di atasnya didekantasi. Pati disuspensikan dengan 100 mL etanol 95 %, dekantasi lagi. Saring melalui penyaring Buchner. Pati dikeringkan pada suhu kamar.

9. Hidrolisis pati
Campur 1 gr pati dengan 100 mL air, setelah homogen tuangkan perlahan-lahan ke dalam 90 mL air mendidih sambil terus diaduk-aduk sampai larutan menjadi “opalescent”.
a. Masukkan 25 mL larutan ke dalam sebuah gelas piala, tambahkan 10 tetes HCl pekat, dan panaskan dalam penangas air. Setiap 3 menit ambil satu tetes larutan dan tes dengan iodium. Pada waktu yang sama diambil lagi 3 tetes larutan dan ditambahkan pereaksi Benedict kemudian dipanaskan dalam penangas air, amatiderajat reduksi yang terjadi dan bandingkan dengan tes iodium.
b. Ke dalam 2 tabung reaksi masukkan masing-masing 5 mL larutan pati.Tambahkan beberapa tetes larutan iodium ke dalam setiap tabung. Hangatkan sebuah tabung perlahan-lahan. Perhatikan hilangnya warna. Dinginkan kembali dan perhatikan warnanya. Ke dalam tabung yang lain tambahkan larutan natrium tiosulfat 1% tetes demi tetes sehingga warna biru hilang.

10. Glikogen
Masukkan ke dalam cawan kira-kira 25 gr hati dengan 50 ml air dan panaskan sehingga mendidih. Tambahkan sedikit asam asetat untuk mengendapkan protein. Teruskan mendidihkan campuran tersebut sambil terus mengaduknya selama 20 menit sehingga volumenya tinggal separuh dari semula. Perhatikan kekeruhan larutan tersebut.
Saring selagi panas dan bagi filtrate menjadi dua bagian.
a. Pada bagian pertama ( 2/3 filtrat ) lakukan tes-tes berikut:
1) Tambahkan 5 tetes lugol pada 5 mL filtrate, bandingkan terhadap air sebagai blanko. Tambahkan 1 tetes NaCl 10% agar tes lebih sensitive. Teteskan lebih banyak lugol. Apa yang terlihat? Bagaimana bila dipanaskan?
2) Lakukan tes benedict terhadap filtrate.
3) Pada 10 mL filtrate tambahkan 10 tetes HCl pekat dan didihkan selama 10 menit. Dinginkan dan netralkan dengan NaOH, lalu lakukan tes Benedict. Bagaimana hasilnya.
b. Pada bagian kedua tambahkan alcohol 95% 4 kali lebih banyak. Glikogen akan mengendap. Diamkan beberapa saat dan buang cairan jernih di bagian atas, lalu saring sisanya. Keringkan presipitat antara 2 kertas saring dan lakukan tes berikut terhadap bubuk glikogen tersebut:
1) Daya larut dalam air, asam encer, basa encer, NaCl 10%..
2) Lakukan Test Iodium.

VI. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

1. Tes Mollisch
Larutan Pengamatan Kesimpulan
Glukosa 1% cincin ungu +
Galaktosa 1% cincin ungu +
Laktosa 1% cincin ungu +
Sukrosa 1% cincin ungu +

Persamaan reaksi :

•

Uji umum untuk karbohidrat adalah uji Molisch. Apabila larutan karbohidrat diberi beberapa tetes pelarut Molisch (alfa naftol dalam etanol) kemudian ditambah asam sulfat pekat secukupnya sehingga terbentuk 2 lapisan cairan, maka pada bidang batas kedua lapisan tersebut akan terbentuk cincin ungu yang disebut kwnoid.
Semua larutan gula yang diuji pada test molish ini dapat dioksidasi karena test molish adalah uji umum untuk karbohidrat. Apabila larutan gula yang diberi pereaksi ini dipanaskan terlalu lama maka dapat menyebabkan cincin ungu terjadi lebih cepat.

2. Test Benedict

Larutan Pengamatan Kesimpulan
Glukosa 1% 5’=Endapan merah bata +++
Fruktosa 1% 1’=Kuning,5’=endapan merah bata ++
Laktosa 1% 5’=endapan merah bata +
Sukrosa 1% Tidak terbentuk endapan _
Amilum 1% Tidak terbentuk endapan _

Persamaan Reaksi
O O
|| ||
R — C — H + Cu2+ [o] R — C — OH + Cu2O ↓ (merah bata)
OH-

1. Larutan tembaga alkalis akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehid dengan kuprooksida yang berwarna merah bata.
2. Dari percobaan diperoleh hasil positif pada larutan glukosa, laktosa dan fruktosa. Sedangkan amilum dan sukrosa memberikan hasil negatif terhadap uji ini, karena amilum merupakan polisakarida dan juga karena gugus aldehidnya terikat kuat satu sama lain dan panjang sehingga tidak dapat bereaksi dengan pereaksi. Sukrosa tidak dapat mereduksi sebab tidak mempunyai OH-laktol (OH yang terikat pada atom C pertama), sehingga gugus O-nya sudah terikat pada atom C glukosa dan fruktosa dan membentuk sukrosa yang bergugus keton.

3. Test Barfoed

Larutan Pengamatan Kesimpulan
Glukosa 1% 1’=endapan merah bata +
Galaktosa 1% 1’=endapan merah bata +
Laktosa 1% Tidak terbentuk endapan -
Sukrosa 1% Tidak terbentuk endapan -

1) Jawab : Larutan gula yang dioksidasi adalah larutan glukosa 1% dan galaktosa 1%.
2) Bila larutan dipanaskan terlalu lama akan menyebabkan disakarida terhidrolisis menjadi monosakarida, maka akan memberikan hasil uji positif terhadap test Barfoed. Test ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida. Hasil positif ditandai dengan larutan biru dan bagian bawah terdapat endapan kemerahan.

4. Test Seliwanoff

Larutan Pengamatan Kesimpulan
Glukosa 1% Bening -
Fruktosa 1% Merah (mereduksi) +
Sukrosa 1% Merah (mereduksi) +

• Uji Seliwanoff dapat dipakai untuk membedakan sukrosa dari fruktosa. Fruktosa mempunyai gugus keton, sedangkan sukrosa merupakan disakarida yang terdiri dari glukosa dan fruktosa. Gugus aldehid dari sukrosa yang bereaksi dengan pereaksi Seliwanoff, sehingga percobaan yang terjadi lebih lambat, dibandingkan dengan fruktosa. Warna larutan yang dihasilkan oleh sukrosa lebih muda dibandingkan fruktosa.

5. Reaksi Tollens

Larutan Pengamatan Kesimpulan
Arabinosa 1% Merah anggur ++
Glukosa 1% Kuning(bagian bawah) -
Gummi Arabikum 1% Merah anggur +

Jawab: Larutan gula yang memberikan hasil positif adalah arabinosa dan gummi arabikum, karena keduanya merupakan gula pentosa, sedangkan glukosa merupakan gula heksosa, sehingga memberikan hasil yang negatif.

6. Hidrolisis sukrosa
Setelah dihidrolisis, larutan memberikan hasil positif terhadap uji benedict dan seliwanoff, dengan membentuk endapan merah. Reaksi ini menunjukan bahwa Sukrosa sudah terhidrolisis menjadi Fruktosa dan Sukrosa. Karena Fruktosa dan Glukosa adalah monosakarida, maka memberi hasil positif Pada test Benedict dan seliwanoff.

7. Glikolisis pada Ragi

Tabung Keterangan CO2 yang terbentuk Hisapan pada ibu jari
I. Glukosa 2 ml + aquadest 14 ml Tinggi gas CO2 = 1 cm +++
II. Glukosa 2 ml + aquadest 14 ml (100 0 C) Tidak terbentuk Gas CO2 _
III. Glukosa 2 ml + NaF 0,5 ml Tinggi gas CO2 = 0,7 cm ++
IV. Glukosa 2 ml + Na Arsenat 0,5 ml Tinggi CO2 = 0,5 cm +

• Hasil akhir glikolisis anaerob pada ragi akan menghasilkan etanol dan CO2. Percobaan ini untuk melihat perbedaan reaksi glikolisis tanpa dan dengan inhibitor.
• Pada tabung I, glikolisis yang terjadi ditandai terbentuknya etanol dan CO2. Proses ini dapat berlangsung baik karena enzim yang terdapat pada ragi masih aktif.
• Pada tabung II, glikolisis yang terjadi dihambat dengan cara menambahkan air panas (mendidih) pada ragi. Suhu panas karena air panas tersebut menyebabkan enzim rusak, enzim terdenaturasi pada suhu tinggi . Akibatnya reaksi glikolisis tidak berjalan dan ditandai dengan tidak terbentuknya gelembung CO2.
• Pada tabung III, proses glikolisis terhambat oleh larutan Fluorida yang berfungsi sebagai inhibitor reaksi glikolisis, sehingga gas CO2 yang dihasilkan lebih sedikit. Larutan Fluorida ini menghambat pembentukan fosfoenol piruvat dari 2-fosfogliserat.
• Pada tabung IV, proses glikolisis terhambat oleh larutan Arsenat yang berfungsi sebagai inhibitor reaksi glikolisis, sehingga gas CO2 yang dihasilkan lebih sedikit. Larutan Fluorida ini menghambat pembentukan fosfoenol piruvat dari 2-fosfogliserat.
• Pada penambahan NaOH, hisapan pada ibu jari yang paling kuat adalah pada tabung I. Semakin banyak CO2 yang terbentuk, maka semakin kuat isapan pada ibu jari.
• Persamaan reaksi:

Fosfogliserat Fosfoheksosa Fosfofruktokinase
α-D-Glukosa kinase α-D-Glukosa 6-Fosfat isomerase Fruktosa 6-fosfat Fruktosa
Mg2+ ATP Mg2+ ADP 1,6-bisfosfat
ATP ADP

3-fosfogliserat 1.3-bisfosfogliserat Gliseraldehid 3-fosfat Dihidroksi aseton Fosfat
ATP Mg2+ ADP Mg2+
NAD + H+ NAD+
Fosfogliserat
Mutase Rantai respirasi ½ O2
Fosfogliserat H2O
2-Fosfogliserat
3 ADP + Pi 3 ATP
Flourida
H2O
Enolase

Fosfoenolpiruvat

ADP
Piruvat kinase

ATP NADH + H+ NAD+
Spontan
Enol (Piruvat) (Keto) Laktat
Piruvat Laktat dehidrogenase

8. Pembuatan Pati (amilum) dari kentang
Pati yang diperoleh dari cairan yang berasal dari kentang yang dihaluskan dan disaring, kemudian disuspensikan dengan etanol 95% berbentuk serbuk berwarna putih setelah didekantasi dengan penyaring Buchner. Pati ini disebut dengan “Amylum Solani” (amylum yang berasal dari kentang).
Hasil: Amilum yang terbentuk berwarna putih.

9. Hidrolisis Pati
a. Larutan pati di tambahkan HCl pekat dengan tujuan mempercepat hidrolisis. Larutan dipanaskan, tiap 5 menit ditest iodium dan test Benedict.

Persamaan reaksi:
Iodium + Amylum  Ikatan iodium amylum (biru)
I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + NaI
Tabung Waktu Test Iodium Test Benedict Kesimpulan
1 5’ ++++ (ungu tua) - Belum terhidrolisis
2 10’ +++ (ungu muda) - Belum terhidrolisis
3 15’ ++ (coklat) + Sedikit terhidrolisis
4 20’ + (coklat muda) ++ Sedikit terhidrolisis
5 25’ - +++ Terhidrolisis
6 30’ - +++ Terhidrolisis

Uji Iodium mulai negative pada tabung ke 5, Sedangkan pada penambahan pereaksi Benedict yang kemudian dipanaskan mula-mula dihasilkan larutan berwarna hijau tua lalu lama kelamaan mulai terbentuk endapan kuning coklat. Hal ini disebabkan pati terhidrolisis menjadi disakarida dan kemudian menjadi monosakarida secara sempurna. Benedict mulai memberikan hasil positif pada tabung ke 6.
Hidrolisis yang praktikan lakukan berlangsung relative cepat mungkin disebabkan pati dipanaskan dengan sempurna.
Persamaan reaksi:

Amylum HCl(p) Amylodekstrin HCl(p) Eritrodekstin HCl(p)
↑ ↑ ↑

Glukosa Maltosa Akrodekstrin

b. Tabung I setelah diberi iodium terbentuk warna biru ungu, setelah dipanaskan warna biru hilang dan menjadi jernih. Setelah didinginkan tetap jernih. Reaksi yang terjadi adalah reaksi irreversible.
Tabung II setelah diberi iodium terbentuk warna biru ungu, kemudian ditambahkan natrium tiosulfat 1% maka larutan menjadi jernih karena tiosulfat memecah ikatan antara amilum dan iodium.

10. Glikogen
A. 1. Pada penambahan lugol akan menghasilkan endapan coklat kemerahan, kemudian setelah di tambah 1 tetes NaOH 10% endapan tetap merah coklat dan jika dipanaskan endapan menipis.
2. Jika filtrat dilakukan tes Benedict maka akan terbentuk larutan berwarna hijau(-) karena filtrat masih polisakarida, kemudian dipanaskan selama 10’ maka terbentuk endapan merah bata karena polisakaridanya terhidrolisis menjadi glukosa sehingga memberi hasil positif pada uji ini.
3. Bila filtrat ditambahkan HCl pekat dan kemudian dipanaskan, maka pada saat dilakukan test Benedict akan memberikan hasil yang positif, yaitu dengan munculnya endapan merah bata. Hal ini disebabkan karena penambahan HCl pekat dan pemanasan, akan menyebabkan pecahnya glikogen menjadi gugus glukosa sehingga memberikan uji (+) pada test Benedict.

B. 1. Bubuk glikogen sukar larut dalam air, basa encer, sedangkan dalam NaCl 10% dan dalam asam encer larut.
2. Test Iodium pada bubuk glikogen menimbulkan uji positif dengan terbentuknya endapan ungu hitam.

VII. KESIMPULAN

Untuk mengidentifikasi karbohidrat digunakan test molish ( dengan terbentuk cincin ungu ) sedangkan untuk mengidentifikasi golongan pereduksi digunakan test benedict untuk membedakan mana yang golongan pereduksi dan mana yang golongan non pereduksi.
Test Barfoed digunakan untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan adanya endapan merah bata menunjukkan hasil yang positif. Test Tollens spesifik untuk pentosa dengan berubahnya larutan menjadi berwarna merah. Sedangkan Test Seliwanoff spesifik untuk ketosa.

Dari uji-uji yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa karbohidrat mempunyai sifat-sifat sebagai berikut :
a) Selalu positif apabila menggunakan uji molish karena molish adalah reaksi umum untuk karbohidrat.
b) Apabila diglikolisis secara anaerob makan akan menghasilkan CO2 dan H2O.
c) Polisakarida dapat dihidrolisis dengan cara pemanasan dan disertai penambahan asam pekat sebagai katalis.
d) Monosakarida dan disakarida kecuali sukrosa dapat teroksidasi (golongan reduksi) sedangkan polisakarida merupakan golongan non pereduksi.

Daftar Pustaka

Anonim. Penuntun Praktikum Kimia Dasar Umum. Universitas Indonesia FMIPA Jurusan Kimia. 1998 : 115-118.
Murray RF; Granner OK; Rodwell V. Harper’s Review of Biochemistry. Penerbit : Buku Kedokteran. Jakarta. 1995.
Drs. Slamet Prawirohartono; Prof. Dr. Suhargono Hadisumarto. Sains Biologi-3A. Penerbit Bumi Aksara. 1999 : 65-66.

Lipid

II. TEORI
Lipid adalah segolongan senyawa organik yang terdapat di dalam alam dan mempunyai sifat-sifat:
1. Tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut-pelarut lemak seperti eter, kloroform, alkohol panas dan benzene.
2. Berhubunagn erat dengan asam lemak.
3. Dapat digunakan oleh organisme hidup.
Lipid dapat diekstraksi oleh jaringan binatang maupun tumbuh-tumbuhan dengan menggunakan pelarut lemak. Hasil ekstraksi merupakan campuran yang kompleks diantaranya: trigliserida, wax, fosfolipid, glikolipid, bermacam-macam sterol dan senyawa-senyawa lain yang terbentuk sebagai hidrolisa zat-zat tersebut diatas. Trigliserida, kolesterol dan ester kolesterol dinamakan juga lipid netral karena tidak bermuatan.

Klasifikasi
Menurut Bloor, lipid dapat dibagi dalam tiga golongan yaitu:
1. Simple Lipid
Merupakan ester asam-asam lemak dengan bermacam-macam alkohol, yang termasuk simple lipid yaitu:
a. Lemak netral dan minyak
Ialah ester asam-asam lemak dengan gliserol. Minyak ialah lemak yang berbentuk cair pada suhu kamar.
Contoh: Tristerin, tripalmitin, dipalmitostearin, distearopalmitin.
b. Wax
Ialah ester asam-asam lemak dengan alkohol alifatik yang mempunyai rantai karbon panjang.

2. Compound Lipid
Compound lipid merupakan ester asam-asam lemak yang pada hidrolisa menghasilkan asam lemak, alkohol, dan juga zat-zat lain.
a. Fosfolipid
Hidrolisa fosfolipid menghasilkan asam lemak, gliserol (atau alkohol lain yang bukan gliserol), asam folat dan senyawa-senyawa lain. Contoh fosfolipid:
1. Asam fosfatidat (fosfatidil gliserol), hanya mengandung gliserol, asam lemak dan asam fosfat. Difosfatidilgliserol dikenal dengan nama kardiolipin dan terdapat di dalam mitokondria.
2. Fosfatidilkolin (lesitin), mengandung asam fosfat dan kolin.
3. Fosfatidiletanolamin (sefalin), mengandung asam fosfatidat dan etanolamin.
4. Fosfatidil inositol (lipositil), mengandung asam fosfatidat dan inositol.
5. Fosfatidil serin, mengandung asam fosfatidat dan asam amino serin.
6. Plasmalogen, menyerupai lesitin dan sefalin, kecuali ikatan ester asam lemak pada posisi pada karbon gliserol diganti oleh ikatan ester dengan suatu alkohol tak jenuh.
7. Sfingomielin, tidak mengandung gliserol. Pada hidrolisa akan dihasilkan asam lemak, asam fosfat, kolin, dan suatu alkohol yang mengandung gugus amina yang disebut sfingosin.

b. Glikolipid (Serebrosida)
Glikolipid mengandung asam lemak, sfingofusin dan karbohidrat (galaktosa/glukosa). Sulfatida ialah serebrosida yang mengandung sulfat. Gangliosida mengandung, disamping glukosa/galaktosa, asam lemak dan sfingosin juga mengandung asam N-asetilneraminat dan hexosamin.

3. Derivat Lipid
Derivat lipid ialah semua senyawa yang dihasilkan pada hidrolisa simple dan compound lipid yang masih mempunyai sifat-sifat seperti lemak dimasukkan dalam golongan ini.

Asam-asam Lemak
1. Dengan rantai karbon jenuh.
Umumnya sam-asam lemak yang terdapat di alam mengandung jumlah atom C genap (asam asetat, asam butirat, asam kaproat, asam laurat, asam sterat dan asam arachidat).
2. Dengan rantai karbon yang mengandung ikatan rangkap.
Contoh: asam oleat, asam linoleat dan asam arachidonat. Yang tiga terakhir digolongkan dalam asam lemak essensial, karena diperlukan untuk pertumbuhan optimum dan tidak dibentuk didalam tubuh dalam jumlah yang cukup untuk keprluan jaringan.

Umumnya asam lemak jenuh lebih banyak terdapat didalam lemak hewan, sedangkan asam lemak tak jenuh lebih banyak didalam minyak tumbuh-tumbuhan
Dalam keadaan murni, pada umumnya lemak tidak mengandung rasa, tidak berwarna, dan tidak berbau. Warna lemak atau minyak yang terdapat dialam disebabkan oleh bermacam-macam pigmen.
Tipe lemak mempunyai titik lebur yang ditentukan oleh asam lemaknya. Sifat ini dapat dipakai untuk memisah-misahkan campuran bermacam-macam lemak. Sebagai contoh: Titik lebur tristearin 71°C dan trielin -5°C.
Asam-asam lemak tak jenuh yang terdapat dialam mudah mengalami oksidasi dan membentuk bermacam-macam zat yang menyebabkan lemak berbau tengik. Zat-zat tersebut tidak dapat dicernakan dan diantaranya ada yang bersifat racun. Untuk mencegah lemak menjadi tengik, dapat ditambahkan antioksidan misalnya hidroquinon.
Asam-asam lemak tak jenuh dapat menghilangkan warna iodium. Hal ini disebabkan karena adisi iodium pada ikatan rangkap. Berdasarkan sifat ini, iodium dapat dipakai untuk menmentukan banyaknya ikatan rangkap di dalam sejumlah tertentu lemak (Angka Iodium= jumlah gram yang dapat diadisi oleh 100 gram lemak).

III. ALAT DAN BAHAN

Alat-alat:
- Tabung reaksi
- Beaker glass
- Batang penagduk
- Labu Erlenmeyer
- Pipet tetes
- Buret dan statif
- Kertas saring-
- Erlenmeyer bertutup glass
- Gelas ukur
- Penangas air
- Spatel
- Tabung sentrifugasi

Bahan-bahan:
- Adeps lanae
- Margarin
- Aquadest
- Larutan Iodium
- Eter
- KOH-Etanol 0,5 N
- Kloroform
- HCL 0,5 N
- NaOH 0,1 N
- Indikator PP
- Minyak kelapa
- KBrO3 0,2 N
- Na2CO3 0,5 %
- KBr
- Etanol
- HCL 4 N
- Larutan KI 16 %
- Na-tiosulfat 0,1 N
- Merah telur
- Aseton
- KOH dlm etanol 10%
- Larutan kolesterol 0,05% dlm CHCl3
- Asam asetat anhidrat - H2SO4 (p)

IV. PERCOBAAN DAN HASIL PENGAMATAN
1. Percobaan daya larut
Untuk memeriksa daya larut suatu zat terutama lipid sejumlah kecil zat tersebut dilarutkan dalam beberapa ml pelarut. Derajat kelarutan dapat dilihat secara langsung. Dapat juga larutan dituang perlahan-lahan (atau disaring dengan kertas saring kering) ke dalam sebuah gelas arloji. Pelarut dapat diuapkan dengan pertolongan penangas uap. Jumlah residu menunjukkan jumlah zat yang larut dalam larutan yang diperiksa.
a. Periksalah daya larut lemak domba dalam air, alkohol panas, alkohol dingin, eter, dan kloroform. Taruhlah setetes larutan dalam eter pada sehelai kertas saring. Perhatikan bercak lemak setelah eter menguap.

Berikut merupakan hasil pengamatan kelarutan lemak domba:
Pelarut Kelarutan
Air Tidak larut
Alkohol panas Tidak larut
Alkohol dingin Tidak larut
Eter Larut
Kloroform Larut
Test bercak lemak  ada bercak transparan (+)

b. Masukkanlah sedikit lemak padat ke dalam tabung reaksi. Tambahkanlah 2 ml air dan hangatkanlah dalam penangas uap Perhatikan bahwa lemak akan mencair dan terapung pada permukaan air. Tambahkanlah beberapa ml NaOH dalam alkohol. Panaskan kembali. Larutan akan menjadi jernih. Kocok dan perhatikan pembentukkan busa yang cepat. Terangkan.

Berikut merupakan hasil pengamatan kelarutan lemak padat:
Setelah ditambahkan NaOH dalam alkohol, dipanaskan, lalu diangkat, dikocok  Mula-mula terlihat lemak mengapung, terbentuk busa, kemudian busa tersebut cepat menghilang.

c. Periksalah daya larut minyak kelapa dalam air, alkohol panas, alkohol dingin, eter dan kloroform. Lakukan test bercak lemak. Masukkanlah kedalam tabung reaksi 1 ml minyak dan 3 ml air, kocok dan tambahkanlah 1 ml larutan natrium karbonat 0,5 % dan kocok lagi. Bagaimana pengaruh natrium karbonat terhadap kestabilan emulsi.

Berikut merupakan hasil pengamatan kelarutan minyak kelapa:
Pelarut Kelarutan Pengamatan Bercak
Air Tidak larut Bercak transparan
Alkohol panas Tidak larut Bercak transparan
Alkohol dingin Tidak larut Tidak ada bercak
Eter Larut Bercak transparan
Kloroform Larut Bercak transparan

Test Pengamatan
1 ml minyak kelapa + 3 ml air  kocok + 1 ml larutan Na karbonat 0,5 % Warna larutan menjadi putih susu.
Pengaruh Na karbonat terhadap emulsi adalah menjadikan emulsi tidak stabil.
2. Percobaan untuk menyatakan ikatan tak jenuh
Ambillah 3 buah tabung reaksi kering. Kedalam tabung yang pertama masukkanlah sedikit minyak kelapa, kedalam tabung kedua margarin dan kedalam tabung yang ketiga lemak padat. Kedalam tiap tabung ditambahkan kloroform dalam jumlah sama. Kemudian teteskan kedalam tiap tabung larutan iodium. Goyanglah tabung reaksi pada tiap penambahan iodium. Terangkan apa yang terjadi.

Berikut merupakan hasil pengamatan ikatan tak jenuh pada margarin, minyak kelapa, dan lemak domba:
Zat Uji Pengamatan
Margarin Warna merah keunguan
Minyak kelapa Warna merah jernih
Lemak padat Warna merah kecokelatan (merah hati)

3. Penetapan angka penyabunan
Timbanglah lebih kurang 2 gram minyak kedalam Labu Erlenmeyer, tambahkanlah 25 ml larutan KOH-Etanol 0,5 N dalam jumlah yang sama. Kedua labu di reflux di atas penangas air selama 30 menit sambil diaduk sewaktu-waktu. Titrasi dengan HCL 0,5 N menggunakan indikator fenolftalein. Hitung angka penyabunan dengan rumus:
Angka penyabunan:

a adalah jumlah HCL 0,5 N yang dibutuhkan titrasi zat uji
b adalah jumlah HCL 0,5 N yang dibutuhkan untuk titrasi blangko
g adalah berat minyak yang digunakan

Berikut merupakan penentuan bilangan penyabunan lemak domba:
• Jumlah HCl 0,5 N yang dibutuhkan untuk titrasi zat uji (a) = 10,7 ml
• Jumlah HCl 0,5 N yang dibutuhkan untuk titrasi blanko (b) = 12,8 ml
Jadi, angka penyabunannya:
( 12,8 – 10,7 ) x 28.05 /2 = 29,4525/gr lemak domba

Pada percobaan penentuan bilangan penyabunan ini, praktikan tidak menggunakan KOH-etanol dikarenakan ketersediaan bahan pada awal percobaan. Praktikan menggunakan NaOH-metanol sebagai ganti atas seijin dari asisten laboratorium. Hal ini menyebabkan sedikit pergeseran angka penyabunan dibandingkan dengan penyabunan menggunakan KOH-etanol.

4. Penetapan bilangan Iodium
Timbang lebih kurang 2 gram zat dalam labu Erlenmeyer bertutup gelas, larutkan dalam 10 ml CHCl3 dan berturut-turut tambahkan 25 ml KBrO3 0,2 N; 1,5 gram KBr yang telah dilarutkan dalam 5 ml air dan 7 ml HCL 4 N. Simpan labu di tempat gelap selama 1 jam. Buka sumbat, tambahkan 7 ml larutan natrium tiosulfat 0,1 N dan kocok kuat-kuat. Lakukan titrasi blangko.

Bilangan Iodium : ( b – a) x N Na2S2O3 x 100 x 0,1269
g
a adalah jumlah Na2S2O3 0,1 N yang dibutuhkan untuk titrasi zat uji
b adalah jumlah Na2S2O3 0,1 N yang dibutuhkan untuk titrasi blangko
g adalah berat zat yang digunakan
Berikut merupakan penentuan bilangan Iodium:
• Jumlah Na2S2O3 0,1 N yang dibutuhkan untuk titrasi zat uji (a) = 15,3 ml
• Jumlah Na2S2O3 0,1 N yang dibutuhkan untuk titrasi blanko (b) = 23,9 ml
Jadi bilangan Iodiumnya:
(23,9 – 15,3) x 0,1 x 100 x 0,1269 /2 = 10,9134/gr mentega

5. Ekstraksi kolesterol dari merah telur
Mula-mula telur dipecahkan dan dikeluarkan isinya, kemudian bagian kuning telur dipisahkan dari putihnya, kuning telur dimasukkan kedalam gelas piala 100 ml dan ditimbang beratnya.
Sebanyak 25 ml metanol dalam 12,5 kloroform berturut-turut dituangkan kedalam gelas piala yang berisi kuning telur, lalu diaduk dan didiamkan selama 10 menit. Selanjutnya campuran tersebut disaring dengan kertas saring n0.40 yang telah dibasahkan sebelumnya dengan alkohol, dan ditampung ke dalam gelas piala kering. Endapan yang terbentuk dibilas dengan 20 ml campuran metanol-kloroform 2:1 (v/v). Hasil bilasan tersebut disatukan dengan filtrat. Larutan KCL 1 % kemudian ditambahkan kedalam campuran filtrat dan hasil bilasan dengan volume 1:1.
Seluruh campuran larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah lalu dikocok-kocok hingga terbentuk dua bagian larutan, larutan kloroform akan berada di bagian bawah corong pemisah.
Kemudian larutan kloroform yang melarutkan kolesterol hasil ekstraksi diambil sebanyak 10 ml dan ditampung dalam vial 25 ml, lalu disimpan dalam lemari pendingin untuk analisis kadar kolesterol.

Berikut merupakan hasil pengamatan pada ekstraksi kolesterol dari merah telur:
Terbentuk dua lapisan larutan yang bagian atasnya berwarna putih keruh dan pada bagian bawahnya berwarna kuning. Cairan tersebut kemudian dipisahkan dengan corong pemisah, diambil bagian bawahnya yang berwarna kuning kurang lebih volumenya 10 ml.
6. Percobaan-percobaan dengan kolesterol
a. Reaksi Salkowski
Percobaan ini memerlukan alat-alat yang kering benar.
Metode:
1 ml larutan kolesterol 0,05 % dalam kloroform dicampur berhati-hati dengan 1 ml H2SO4 pekat. Setelah kedua lapisan cairan berpisah lagi akan timbul berturut-turut warna merah, biru, ungu dalam lapisan kloroform. Selai dari itu dalam lapisan asam akan tampak fluorosensi kuning.

Berikut merupakan hasil pengamatan reaksi Salkowski:
Reaksi Salkowski Pengamatan
Larutan standar Terbentuk dua lapisan cairan berwarna merah muda dan bening
Larutan ekstrak Terbentuk dua lapisan cairan berwarna merah cokelat dan merah keunguan

b. Reaksi Liebermann-Burchard
Metode:
1 ml larutan kolesterol standar 0,05 % dalam kloroform ditambah dengan 1 ml pereaksi Liebermann-Buchard (asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat 10:2). Kocoklah hati-hati dan perhatikan warna-warna yang timbul.

Berikut merupakan hasil pengamatan reaksi Liebermann-Buchard:
Reaksi Liebermann-Burchard Pengamatan
Larutan standar + asam asetat anhidrat 10 tetes + 3 tetes H2SO4(p)  terbentuk warna hijau
Ekstrak kolesterol + asam asetat anhidrat 10 tetes + 3 tetes H2SO4(p)  terbentuk warna hijau yang pekat

VI. PEMBAHASAN
1. Percobaan daya larut
Pada tes kelarutan didapat hasil bahwa lemak domba dan minyak kelapa yang bersifat nonpolar larut dalam eter dan kloroform karena keduanya merupakan pelarut organik (nonpolar). Sedangkan pada pelarut polar seperti air dan alkohol, lemak domba dan minyak kelapa tidak dapat larut. Kelarutan suatu zat dalam suatu pelarut ditentukan oleh banyak hal, antara lain adalah sifat kepolaran zat dan pelarutnya. Umumnya zat yang polar dapat larut dalam pelarut yang bersifat polar, namun tidak dapat larut dalam pelarut nonpolar. Begitu juga sebaliknya. Hal ini dikarenakan adanya momen dipol pada zat atau pelarut sehingga dapat berikatan dan berinteraksi dengan sesamanya. Sedangkan pada pelarut nonpolar tidak memiliki momen dipol, sehingga tidak bisa berinteraksi dengan zat yang polar, jadi tidak dapat larut.
Pada tes bercak lemak, adanya bercak transparan pada kertas saring menandakan adanya lemak pada zat tersebut. Pada zat dalam pelarut eter terdapat bercak karena lemak domba telah larut sehingga terbawa pada saat penetesan dan dapat membuat bercak pada kertas.
Pengaruh Na2CO3 terhadap kestabilan emulsi adalah: dengan adanya logam Na menyebabkan emulsi menjadi cepat pecah (terpisah menjadi dua komponennya kembali). Pada saat minyak dikocok bersama air akan terjadi emulsi minyak dalam air, ditandai dengan adanya kekeruhan / larutan berwarna putih. Setelah ditambah Na2CO3, emulsi langsung pecah ditandai dengan adanya lapisan minyak (berwarna kuning) pada permukaan, lapisan air pada bagian bawah, dengan sedikit kekeruhan pada bagian tengah larutan.

2. Percobaan untuk menyatakan ikatan tak jenuh
Percobaan ini dilakukan untuk menyatakan adanya ikatan tak jenuh dalam suatu lemak atau minyak. Bahan-bahan yang digunakan adalah minyak kelapa, margarin, dan lemak padat berupa adeps lanae. Ketiga zat tersebut dilarutkan dalam kloroform karena tidak larut dalam air. Setelah itu, ditambahkan larutan iodium sama banyak pada ketiga zat.
Reaksi yang terjadi adalah reaksi adisi oleh iod. Iod akan memutus ikatan rangkap yang terdapat molekul zat, kemudian iod tersebut akan menggantikan posisi dari ikatan rangkap tersebut melalui reaksi adisi sehingga jumlah ikatan rangkap dalam molekul zat akan berkurang atau menjadi tidak ada sama sekali (jika teradisi semuanya oleh iod). Dengan adanya reaksi ini, maka warna larutan iod akan hilang.
Minyak kelapa mengandung triasil gliserol dengan 80-85 % asam lemak jenuh. Asam lemak utama yang terdapat dalam minyak kelapa adalah asam laurat dan asam miristat (merupakan asam lemak dengan bobot molekul rendah dan memiliki bilangan penyabunan yang tinggi). Selain itu, minyak kelapa juga mengandung asam kaprilat, asam kaprat, dan asam oleat.
Margarin merupakan salah satu produk makanan konsumsi sehari-hari yang dibuat dengan menggunakan bahan baku lemak nabati. Margarin dibuat melalui proses hidrogenasi asam lemak tak jenuh yang bersumber dari tanaman. Margarin adalah emulsi air dalam minyak yang berbentuk padat. Komposisi dari margarin menurut British Nutrition Foundation adalah :
• Lemak (minimum 80 %, tetapi kurang dari 90 %)
• Lemak susu (maksimum 3 % dari total lemak)
• Vitamin A 940-960 IU per ounce (800-100 µg setiap 100 g)
• Vitamin D 80-100 IU per ounce (7,05-8,82 µg setiap 100 g)
Adeps lanae (lemak bulu domba, lanolin) adalah zat serupa lemak yang dimurnikan, diperoleh dari bulu domba Ovis aries Linne (Familia Bovidae) yang dibersihkan dan dihilangakan warna dan baunya. Adeps lanae mengandung air tidak lebih dari 0,25 % dan boleh mengandung antioksidan yang sesuai tidak lebih dari 0,02 %. Adeps lanae mengandung kolesterol, alkohol dan isokolesterol, bersama dengan berbagai ester lainnya. Selain itu, juga terdapat asam lanoserat, asam lanopalmitat, asam karnaubat, asam miristat, asam oleat, dan mungkin asam serotat serta asam palmitat.
Pada hasil percobaan, minyak kelapa, margarin dan adeps lanae memberikan hasil positif yaitu dengan hilangnya warna larutan iod (ungu). Minyak kelapa menghasilkan warna jingga jernih, margarin menghasilkan warna jingga keruh, dan adeps lanae menghasilkan warna kuning. Hal itu berarti pada ketiga zat itu, terdapat ikatan tak jenuh (ikatan rangkap) sehingga dengan penambahan larutan iodium, terjadi reaksi adisi yang menyebabkan hilangnya warna larutan iod. Ikatan tak jenuh yang terdapat dalam margarin lebih banyak daripada ikatan tak jenuh dalam adeps lanae dan minyak kelapa (ikatan tak jenuh dalam margarin > minyak kelapa > adeps lanae). Hal tersebut dapat disimpulkan dari intensitas warna yang terbentuk (jingga keruh > jingga jernih > kuning).

3. Penetapan Angka Penyabunan
Menurut Farmakope edisi III, bilangan penyabunan adalah bilangan yang menunjukkan jumlah mg kalium hidroksida yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas dan menyabunkan ester yang terdapat dalam 1 g zat uji. Caranya adalah dengan menentukan jumlah kelebihan KOH yang tersisa setelah saponifikasi.
Pada percobaan, yang dihitung adalah angka sabun dari margarin. Mula –mula margarin dilelehkan dahulu, kemudian ditimbang 2 gram ke dalam labu erlenmeyer, lalu tambahkan 25 ml larutan KOH-etanol 0,5 N. Etanol digunakan karena margarin tidak dapat larut dalam air, maka untuk meningkatkan kelarutan margarin digunakan etanol. Setelah itu lakukan reflux. Caranya adalah pada bagian atas labu erlenmeyer (yang telah berisi margarin yang dicampur dengan KOH-etanol) diberi corong yang ditutup dengan kaca arloji yang bagian atasnya diberi kapas basah. Lalu dimasukkan ke dalam penangas air selam 30 menit. Dengan adanya pemanasan dan penambahan alkali (KOH) maka margarin akan membentuk gliserol dan sabun atau garam asam lemak. Proses ini lebih dikenal dengan nama saponifikasi. Kemudian dilakukan titrasi dengan HCl 0,5 N dan 1 ml phenolftalein sebagai indikator. Titrasi HCl akan menetralkan KOH yang berlebih dan terbentuklah endapan putih garam netral KCl. Serta kelebihan HCl akan mengubah sabun menjadi asam lemaknya. Larutan HCl tersebut digunakan untuk mengetahui sisa KOH yang tidak bereaksi. Selisih antara titrasi blanko dengan larutan yang berisi zat uji adalah jumlah KOH yang digunakan untuk menyabunkan lemak. Titik akhir titrasi diperoleh apabila warna larutan telah berubah dari merah muda menjadi tidak berwarna. Prosedur ini dilakukan baik terhadap larutan yang berisi zat uji maupun terhadap blanko.
Dari penentuan angka sabun ini dapat ditentukan atau diperkirakan panjang rantai karbon dalam gugus asam dari molekul minyak atau lemak dan dapat juga ditentukan jumlah asam yang terikat pada ester. Besar kecilnya angka penyabunan tergantung pada panjang pendeknya rantai karbon asam lemak. Atau dengan kata lain besarnya angka penyabunan tergantung pada berat molekul asam lemak tersebut. Makin besar berat molekul lemak maka makin makin kecil bilangan penyabunannya, seperti tampak pada tabel berikut :

Angka penyabunan yang diperkirakan Berat sample (gram)
0-59 10,0-12,0
60-79 9,0-11,0
80-99 7,0-8,6
100-119 5,7-7,0
120-139 4,9-5,9
140-149 4,2-5,1
160-179 3,9-4,8
180-199 3,3-4,1
200-219 3,0-3,7
220-239 2,7-3,4
240-259 2,5-3,1
260-300 2,2-2,7

Setelah semua asam lemak bereaksi dengan KOH akan terjadi reaksi :
KOH + HCl → KCl + H2O
Setelah semua KOH habis, reaksinya :
H+ + PP → tidak berwarna
Untuk menghitung angka penyabunan digunakan rumus :

a = jumlah HCl 0,5 N untuk titrasi larutan yang berisi zat uji
b = jumlah HCl 0,5 N untuk titrasi blanko

Namun, pada percobaan kali ini, praktikan tidak menggunakan KOH melainkan NaOH, namun pada prinsipnya adalah sama.

4. Penetapan Bilangan Iodium
Menurut Farmakope Indonesia edisi III bilangan Iodium adalah bilangan yang menunjukkan jumlah gram Iodium yang diserap oleh 100 gram zat.
o Bila bilangan iod 130 : drying oils
Angka iodium dapat digunakan untuk menentukan derajat ketidakjenuhan asam lemak yang terkandung di dalamnya, tetapi tidak dapat memberikan informasi yang signifikan mengenai jumlah ikatan tidak jenuh yang ada dalam sampel. Dari sumber yang praktikan dapatkan, dapat dinyatakan bilangan iodium sebagai berikut:
Asam Lemak Jumlah Ikatan Rangkap Bilangan Iodin
Asam Palmitat 1 95
Asam Oleat 1 86
Asam Linoleat 2 173
Asam Linolenat 3 261
Asam Arakidonat 4 320

Pada zat uji, dalam hal ini margarin yang telah dilelehkan ditimbang 2 gram, setelah itu dilarutkan dalam 10 ml kloroform, dan dicampurkan dengan 25 ml KBrO3 0,2 N dan 1,5 gram KBr yang dilarutkan dalam 5 ml air dan 7 ml HCl 4 N. kemudian diamkan selama 1 jam di tempat gelap. Setelah itu ditambahkan larutan KI 16 % 7 ml yang akan membetuk warna larutan coklat. Pada pendiaman selama 1 jam tersebut akan terbentuk Br2. Br2 dihasilkan dari proses reduksi BrO3- (Br yang berasal dari KBr dioksidasi oleh Br dari KBrO3 membentuk Br2). Br2 yang dihasilkan kemudian sebagian akan mengadisi margarin dan sebagian lagi akan bereaksi dengan larutan KI (I-) membentuk I2, yang kemudian dititrasi dengan Na2S2O3 menjadi I- kembali. Br2 yang mengoksidasi I- menjadi I2 menyebabkan larutan berwarna coklat. Semakin banyak volume Na2S2O3, makin banyak I2 direduksi menjadi I-, sehingga menjadi larutan tidak berwarna. Maksud pendiaman di tempat gelap selama 1 jam setelah margarin dilarutkan dengan bermacam-macam pelarut dan sebelum bereaksi dengan KI adalah supaya BrO3- sebanyak mungkin tereduksi menjadi Br2, sehingga akan banyak bereaksi dengan zat dan larutan KI. Reaksi lengkapnya adalah :
2 BrO3- + 10 Br – + 12 H+  6 Br2 + 6 H2O

Bagian Br2 lainnya akan bereaksi dengan penambahan larutan KI :
Br2 + 2 I- I2 + 2 Br – (larutan menjadi berwarna coklat)
I2 yang terbentuk dititrasi denagn menggunakan larutan natrium tiosulfat, dengan reaksi :
I2 + 2 S2O32-  2 I- + S4O62- (larutan menjadi jernih)
Titrasi dihentikan apabila telah terjadi perubahan warna larutan dari coklat menjadi tidak berwarna dan pada bagian bawah larutan terdapat endapan berwarna kuning muda. Titrasi dilakukan dengan menutup mulut erlenmeyer dengan plastik untuk menghindari penguapan I2.
Dari percobaan dibutuhkan larutan natrium tiosulfat sebanyak 7,515 ml untuk larutan uji dan 54,650 ml untuk larutan blanko. Perhitungan bilangan iodium dapat dilakukan dengan menggunakan rumus :
(b-a) x N Na2S2O3 x 100 x 0,1269
g

b = jumlah ml Na2S2O3 0,1 N untuk titrasi blanko
a = jumlah ml Na2S2O3 0,1 N untuk titrasi zat uji

5. Ekstraksi kolesterol dari merah telur
Pertama-tama, praktikan memisahkan kuning telur dari putihnya. Putih telur mengandung protein berupa albumin. Sedangkan kuning telur mengandung berbagai fosfolipid dalam jumlah yang sebanding dengan berat merah telur. Kemudian kuning telur dipisahkan dari putihnya. Merah telur diaduk dengan campuran 25 ml alcohol dan 12.5 ml eter, diamkan sambil dikocok sewaktu-waktu selama 10 menit. Saring ke dalam beaker kering melalui kertas saring yang dibasahi dengan alcohol. Cuci residu di atas kertas saring dengan 10 ml larutan alcohol-eter segar yang dipakai untuk ekastraksi. Uapkan filtrat hingga kering diatas waterbath, larutkan residu di dalam 10 ml eter,tuang perlahan-lahan ke dalam 30 ml aseton sambil diaduk. Endapan yang terjadi adalah lesitin(fosfolipid).
Lesitin atau fosfatidilkolin adalah senyawa fosfogliserol yang mengandung kolin (lesitin mengandung gliserol, asam lemak, asam fosfat, dan kolin). Senyawa ini adalah fosfolipid kolin terdapat dengan jumlah terbanyak di dalam membran sel dan menunjukkan proporsi simpanan kolin yang besar pada tubuh. Kolin sangat penting dalam proses transmisi saraf dan sebagai simpanan, gugus metil yang labil. Lesitin dapat diperoleh dari hewan, kuning telur, kecambah, gandum, ragi, dan kedelai.

Pemisahan fosfatidilkolin dari lemak dan kolesterol dilakukan dengan pelarut eter dan aseton. Lesitin memiliki gugus kolin yang bermuatan positif sehingga lebih larut dalam eter dan kurang larut dalam aseton. Hal ini disebabkan eter memiliki elektron bebas yang dapat diserang oleh muatan positif dari kolin sehingga kolin lebih larut dalam eter daripada aseton yang tidak memiliki elektron bebas.
Filtrat yang diperoleh dari penyaringan lesitin (eter-aseton) diuapkan diatas waterbath sampai menghasilkan suatu pasta. Kemudian, ditambahkan 15 ml larutan KOH dalam etanol 10% lalu disaring. Endapannya adalah sabun, sedangkan filtratnya mengandung kolesterol yang berwarna kuning kemerahan/ kecoklatan (berupa sabun).
Kolesterol merupakan lipid amfipatik dan merupakan komponen penting struktural yang membentuk membran sel serta lapisan eksternal lipoprotein plasma. Kolesterol masuk ke dalam membran bilayer (membran sel) dengan gugus hidroksilnya mengarah ke fase air dan cincin hidrofobiknya berdekatan dengan gugus lemak dan fosfolipid. Gugus hidroksil dari kolesterol membentuk ikatan hidrogen dengan gugus polar fosfolipid.
Kolesterol disintesis dari asetil-koA dalam banyak jaringan dan dikeluarkan dari tubuh lewat empedu. Kolesterol merupakan prekursor semua senyawa steroid dalam tubuh, seperti kortikosteroid, hormon seks, asam empedu dan vitamin D. Kolesterol terdapat dalam segala macam makanan yabg berasal dari hewan seperti kuning telur, daging hati, dan otak.

6. Reaksi Liebermann-Burchard (blanko)
Percobaan ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya kolesterol dengn adanya pereaksi asam astat anhidrad dan H2SO4 (p) akan memberikan perubahan warna dari ungumerah menjadi biru dan kemudian hijau dengan sedikit endapan hitam yang melayang yang disebabkan adanya gugus kromofor dan auksokrom pada kolesterol.

VII. KESIMPULAN
1. Lipid (lemak) larut dalam pelarut organik yang bersifat nonpolar. Pada percobaan untuk menyatakan ikatan tak jenuh terjadi reaksi adisi I2 dengan ketiga zat uji, yaitu margarin, adeps lanae dan minyak kelapa. Hal ini ditunjukkan dengan adanya perubahan warna.
2. Angka penyabunan = 29,4525/gr lemak domba
3. Bilangan Iodium = 10,9134/gr mentega
4. Kolesterol dapat diuji dengan reaksi Liebermann-Burchard karena kolesterol mempunyai gugus kromofor yang memberikan warna dan mempunyai serapan pada panjang gelombang tertentu.
5. Pada minyak kelapa, margarin, dan lemak padat (adeps lanae) terdapat ikatan tak jenuh yang dapat dibuktikan dengan hilangnya warna iodium.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia, halaman 57-58.
Murray, Robert K. et al. 2003. Biokimia Harper Edisi ke-25. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC, halaman 156, 277, 564.

http://www.nutrition.org.uk/information/foodandingredients/marg.html

Urin

II. TEORI

1. Pembentukan Urin

Proses pembentukan urin meliputi tiga tahap, yaitu:

• Filtrasi glomerulus
• Reabsorbsi tubular
• Sekresi tubular

Filtrasi Glomerulus. Pembentukan urin dimulai ketika air dan berbagai bahan terlarut lainnya disarng melalui kapiler glomerulus dan masuk ke kapsul glomerulus (kapsul Bowman. Penyaringan bahan-bahan ini melalui dinding kapiler kurang lebih sama seperti pada penyaringan yang terjadi pada ujung arteriol pada kapiler lain di seluruh tubuh. Hanya saja, kapiler glemerulus bersifat lebih permeabel karena adanya fenestrae pada dindingnya.
Reabsorbsi tubular. Reabsorbsi tubular adalah proses dimana bahan-bahan diangkut keluar dari filtrat glomerulus, melalui epitelium tubulus ginjal ke dalam darh di kapiler peritubulus. Walaupun reabsorbsi tubulat terjadi di seluruh tubulus ginjal, peritiwa ini sebagian besar terjadi di tubulus proksimal. Adanya mikrovili di tubulus proksimal akan meningkatkan luas permukaan yang bersentuhan dengan filtart glomerulus sehingga meningkatkan proses reabsorbsi. Berbagai bagian dari tubulus ginjal berfungsi untuk mereabsorbsi zat yang spesifik. Sebagai contoh, reabsorbsi glukosa terjadi terutama melalui dinding tubulus proksimal dengan cara transpor aktif. Air juga direabsorbsi dengan cepat melalui epitelium tubulus proksimal dengan osmosis.
Sekresi tubular. Sekresi tubular adalah proses dimana bahan-bahan (zat) diangkut dari plasma kapiler peritubulus menuju ke cairan tubulus ginjal. Sebagai hasilnya, jumlah zat tertentu diekskresikan melalui urin dapat lebih banyak daripada jumlah zat yang diperoleh melalui filtrasi plasma di glomerulus.
Urin mengandung:
1. Air dan garam-garam dalam jumlah sedemikian rupa sehingga terdapat keseimbangan antara cairan ekstrasel dan cairan intrasel.
2. Asam dan basa
Sisa-sisa metabolisme yang tidak berguna lagi bagi tubuh
3. Zat-zat yang dikeluarkan dari darah karena kadarnya berlebihan.

Jika kita melakukan urinalisa dengan memakai urin kumpulan sepanjang 24 jam pada seseorang, ternyata susunan urin itu tidak banyak berbeda dari susunan urin 24 jam berikutnya. Akan tetap, jika kita mengadakan pemeriksaan dengan sampel-sampel urin pada saat-saat yang tidak menentu di waktu siang atau malam, akan terlihat bahwa sampel urin dapat berbeda jauh dari sampel lain. Oleh karena itu, penting sekali untuk memilih sampel urin sesuai dengan tujuan pemeriksaan.

Komponen utama Urin manusia
Komponen Garam per 24 jam Perkiraan nisbah
Konsentrasi urin plasma
Glukosa
Asam amino
Amonia
Urea
Kreatinin
Asam urat
H+
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
Cl-
HPO42-
SO42-
HCO3- <0,05
0,80
0,80
25
1,5
0,7
pH 5-8
3,0
1,7
0,2
0,15
6,3
1,2 gr P
1,4 gr S
0-3 <0,05
1,0
100
70
70
20
Sampai 300
1,0
15
5
2
1,5
25
50
0,2

2. Memilih Sampel Urin

 Urin sewaktu
Yaitu urin yang dikeluarkan pada satu waktu yang tidak ditentukan dengan khusus. Urin sewaktu cukup baik untuk pemeriksaan rutin.
 Urin pagi
Yaitu urin yang pertama-tama dikeluarkan pada pagi hari setelah bangun tidur. Urin ini lebih pekat dari urin yang dikeluarkan pada siang hari. Urin pagi baik untuk pemeriksaan sedimen, protein, berat jenis dll.
 Urin post prandial
Merupakan urin yang pertama kali dikeluarkan 1 ½ – 3 jam setelah makan. Sampel urin ini baik untuk pemeriksaan terhadap glukosuria.
 Urin 24 jam
Yaitu urin yang dikumpulkan selama 24 jam. Ccara mengumpulkannya sebagai berikut: jam 7 pagi urin pertama dikeluarkan, urin ini dibuang. Semua urin yang dikeluarkan kemudian, termasuk juga urin jam 7 pagi esok harinya, harus dapat ditampung dalam botol urin yang tersedia dan isinya dicampur. Botol harus bersih dan biasanya memerlukan zat pengawet.

Urin 24 jam dapat digunakan untuk pemeriksaan kuantitatif semua zat dalam urin. Selain itu, dikenal juga urin siang 12 jam, urin malam 12 jam, urin 2 jam, urin 3 gelas, urin 2 gelas dsb.

III. ALAT DAN BAHAN

Alat :
 Tabung Reaksi
 Pipet Volumetri
 Labu takar 100 ml
 Hidrometer
 Tabung Urinometer
 Indikator Universal
 Kertas lakmus
 Penangas air
 Kertas saring
 Labu Erlenmeyer
 Cawan penguap
 Buret dan statif
 Bunsen
 pipet tetes

Bahan:
 Urin 24 jam
 Ag Nitrat
 Fenolftalein
 Kristal Asam urat
 NaOH
 Asam asetat 2%
 NH4OH
 Asam sulfosalisilat 3%
 Eter
 Glukosa 0,3% ; 1%;2%;5%
 Pereaksi Nessler
 Pereaksi Benedict
 HCL encer
 Larutan standar kreatinin.
 BaCl2
 Zn
 Larutan Pb-asetat
 Asam pikrat
 Asam nitrat

IV. PROSEDUR

Percobaan Urin

1. Sifat-sifat Urin

Catatlah hal-hal dibawah ini :
1. Volume dalam ml.
2. Warna, bau dan kejernihan.
3. pH urin dengan menguji reaksi terhadap lakmus dan kertas indicator universal. Juga dengan fenolftalein.
4. Berat Jenis
Terlebih dahulu ketelitian hydrometer yang akan digunakan harus diuji terhadap air suling. Bila kesalahan tidak terlalu besar, dapat dilakukan koreksi. Perlu diperhatikan bahwa semua toluene harus dibuang.
Metoda :
Isilah sebuah tabung urinometer dengan urin. Busa yang mungkin dibuang dengan memeakai sepotong kertas saring atau dengan setetes eter. Letakkan hydrometer didalamnya. Hydrometer tidak boleh menyentuh tabung. Catatlah suhu urin tersebut. Tiap-tiap urinometer telah ditera pada suhu tertentu. Bila suhu urin tidak sama dengan suhu tera, lakukan koreksi sebagai berikut :
Tambahkan 0,001 pada angka yang dinyatakan urinometer bagi tiap penambahan suhu 3 0C diatas suhu tera, atau dikurangi 0,001 untuk setiap perbedaan suhu 3 0C dibawah suhu tera.

Pengamatan :
1. Volume : 1,5 liter
2. Warna urin : Kuning tua.
Bau urin : Ammonia
Kejernihan : Jernih
3. pH urin : 6 (Indikator universal)
Lakmus biru : merah
Lakmus merah : merah.
Fenolftalein : tetap jernih
4. Berat Jenis urin : 1.0058

2. Jumlah zat padat total

Kalikan kedua angka terakhir dari BJ urin tersebut dengan angka 2,6. hasilnya menyatakan secara kasar jumlah zat padat total (gram) dalam 1 liter urin/24 jam.
Pengamatan :
b.j urin x 2,6 = 58 x 2.6 = 150.8 dalam 1 liter urin

3. Garam-garam ammonium

Metoda :
Tambahkan NaOH pada beberapa ml urin hingga reaksinya alkalis. Panaskan. Perhatikan bau yang timbul dan uji uap yang terbentuk dengan kertas lakmus yang dibasahi atau dengan pereaksi nessler yang diteteskan pada kertas saring.
Pengamatan :
Bau yang timbul adalah bau ammoniak.
Uji uap dengan kertas lakmus merah : biru
Dengan pereaksi nessler yang diteteskan pada kertas saring : noda berwarna coklat

4. Belerang dalam urin

Belerang yang terdapat dalam urin dibedakan atas 3 bentuk :

a. Belerang Anorganik

Merupakan bagian terbesar (85-90%) dari belerang teroksidasi dan berasal terutana dari metabolisme protein.

Metoda :

Pada 10 ml urin tambahkan sedikit HCl encer dan BaCl2. terlihat endapan putih. Saringlah campuran ini, uji filtrate terhadap belerang etereal.

Pengamatan :

Terbentuk Endapan putih.

b. Belerang etereal

Merupakan senyawaan asam sulfat dengan zat0zat organic seperti indol, kresol, fenol dan sebagainya. Zat-zat organic tersebut berasal dari metabolisme protein, atau pembusukan protein dalam lumen usus. Semuanya terurai pada pemanasan dengan asam. Merupakan 5-15% dari belerang total urin.

Metoda :

Didihkan filtrate dari percobaan (a) selama beberapa menit. Bila tidak terbentuk endapan, tambahkan lagi HCl dan panaskanlah, mungkin perlu ditambahkan BaCl2.

Pengamatan :

Terbentuk endapan putih.

c. Belerang yang tak teroksidasi

Adalah senyawa yang mempunyai gugus –SH, -S dan _SCN, misalnya asam amino yang mengandung S (sistin), tiosulfat, sulfide dan sebagainya. Jumlahnya 5-25% dari belerang total.

Metoda :
Masukkan 10 ml urin dalam tabung reaksi. Masukkan Zn dan sedikit HCl 6N. Tutup tabung tersebut dengan kertas saring yang dibasahi dengan larutan Pb-asetat. Terlihat kertas berwarna hitam.

Pengamatan :
Kertas berwarna hitam

5. Asam Urat

Test Mureksida

Asam urat dioksidasi oleh asam nitrat pekat membentuk asam dialurat dan aloksan. Zat-zat ini berkondensasi dengan ammonia membentuk mureksida (ammonium purpurat) yang berwarna ungu kemerahan.

Metoda:

5 tetes urin diletakkan dalam sebuah cawan penguap. Tambahkan 3 tetes asam nitrat pekat, lalu panaskan sehingga kering pada penangas uap, perhatikan warna merah yang timbul. Setelah dingin tambahkan satu tetes ammonia encer (1 : 100). Perhatikan warna yang terbentuk. Bandingkan dengan menggunakan 0.1 g Kristal asam urat.

Pengamatan :

Setelah pemanasan :

Cawan I (urin) : Kuning Muda
Cawan II (as. urat) : Kuning kemerahan

Setelah penambahan 1 tetes ammoniak.

Cawan I (urin) : Kuning muda
Cawan II (as.urat) : Kemerahan

6. Kreatinin

Reaksi Jaffe

Reaksi ini berdasarkan pembentukan tautometer kreatinin pikrat yang berwarna merah bila kreatinin direaksikan dengan larutan pikrat alkalis. Warna ini akan berubah menjadi kuning apabila larutan diasamkan.

Metoda :

Masukkan 5 ml urin ke dalam sebuah tabung reaksi dan 5 ml ke dalam tabung yang lain. Tambahkan pada masing-masing tabung 1 ml larutan asam pikrat jenuh dan 1 ml NaOH 10%. Perhatikan warna yang terbentuk. Tambahkan HCl pada salah satu tabung. Bandingkan hasilnya terhadap tabung yang ditambahkan HCl.

Pengamatan :

Tabung I dan II setelah ditambahkan asam pikrat jenuh dan NaOH 10% terbentuk warna merah coklat (terang-jernih).
Tabung II setelah ditambahkan HCl terbentuk warna kuning.

7. Glukosa

Adanya glukosa dalam urin dapat dinyatakan berdasarkan sifat glukosa yang dapat mereduksi ion-ion logam tertentu dalam larutan alkalis. Test ini tidak spesifik terhadap glukosa, gula-gula lain yang berdaya reduksi maupun zat-zat lain yang bukan gula dapat juga memperlihatkan hasil positif.

Test Benedict (Semi Kuantitatif)

Dengan test ini dapat diperhitungkan secara kasar kadar gula dalam urin (semi kuantitatif).

Metoda:

Campurlah 2.5 ml pereaksi benedict kualitatif dengan 4 tetes urin. Panaskan selam 5 menit pada penangas air mendidih. Biarkan menjadi dingin perlahan-lahan. Lakukan test ini terhadap urin yang mengandung (1) glukosa 3%; (2) glukosa 1%; (3) glukosa 2% dan (4) glukosa 5%.

Penafsiran :

Warna Penilaian Kadar
Biru/ hijau keruh
Hijau/ kuning hijau
Kuning/ kuning kehijauan
Jingga
Merah 0
+
++
+++
++++ -
Kurang dari 0,5%
0,5 – 1,0 %
1,0 – 2,0 %
Lebih dari 2,0 %

Pengamatan :

Tabung I = hasil negative
Tabung II = kuning hijau endapan merah + ( < 0,5 % )
Tabung III = larutan kuning kehijauan dengan endapan merah ++ ( 2,0 % )

Percobaan Urin Kuantitatif

1. Penetapan Kadar Kreatinin Urin (Folin)

Dasarnya adalah metode Jeffe. Kreatinin bereaksi dengan asam pikrat dalam larutan alkalis membentuk tautometer kreatinin pikrat yang berwarna merah.
Pereaksi :
1. Larutan Asam pikrat jenuh
2. NaOH 10%
3. Larutan Standard kreatinin mengandung 1 mg/ml

Metoda :

Sediakan 2 labu takar 100 ml. isilah labu pertama dengan urin 1 ml dan labu kedua dengan 1 ml larutan standard. Tambahkan pada masing-masing labu tepat 20 ml larutan asam pikrat jenuh dan 1,5 ml larutan NaOH 10%. Kocok perlahan-lahan dan biarkan selama 25 menit. Encerkan sampai 100 ml dan campur dengan sebaik-baiknya. Lakukan pembacaan segera dengan calorimeter visual. Pada panjang gelombang 540 nm. Buat blanko dengan menggunakan 1 ml air suling.

Penghitungan :

Kadar Kreatinin (g/24jam) = Rs/Ru X 1 ml urin 24 jam/1 X 1/1000

Pengamatan
Rs = 0, 249 nm
Ru = 0, 375 nm

Kadar kreatinin = 0,249/0,375 X 1/1 X 1/1000
= 6,64 x 10-4 g/24jam

2. Penetapan Kadar Klorida Urin (Schales dan Schales)

Urin dititrasi dengan Merkuri nitrat dalam suasana asam. Ion-ion Cl diikat oleh merkuri membentuk HgCl2 yang tidak terionisasi. Bila terdapat merkuri nitrat berlebihan, maka ion-ion merkuri tersebut dengan indicator difenilkarbazon akan membentuk warna ungu.

Pereaksi :
1. Larutan Indikator difenilkarbazon 0.1%
2. Larutan Merkuri nitrat N/60
3. Larutan Standard klorida mengandung 10 meq Cl/Liter.

Metoda :

Masukkan dengan pipet volumetric 5 ml urin ke dalam sebuah gelas Erlenmeyer, kemudian tambahkan 5 tetes indicator. Lakukan dalam duplo. Lakukan titrasi dengan larutan merkuri nitrat. Lakukan juga titrasi terhadap 5 ml larutan standard NaCl. Hitunglah jumlah NaCl dalam urin 24 jam.

Penghitungan :

Kadar Klorida Urin = ml merkuri nitrat yang dipakai x 100/A 9meq/Liter)
A = Jumlah ml merkuri nitrat untuk titrasi 5 ml larutan Standard NaCl.
Kadar NaCl urin (mg/Liter) = meq Klorida/Liter X 58,5
Pengamatan :
TE sampel I = 15,5 ml (menggunakan sampel urin 1 ml)
TE sampel II = 15,3 ml (menggunakan sampel urin 1 ml)
TE standard = 4,25 ml (menggunakan standard NaCl 5 ml)

V. PEMBAHASAN

Percobaan Urin

1. Sifat-sifat urin

Pada percobaan sifat-sifat urin, volume urin yang dikumpulkan selama waktu 24 jam sebanyak 1500 ml. Volume yang dapat dikumpulkan atau yang diekskresikan tergantung dari beberapa faktor seperti suhu, intake cairan, kerja fisik, dan faktor patologi seperti penyakit ginjal atau diabetes mellitus. Pada orang dewasa normal volume urin adalah sekitar 600-2500 ml/ 24 jam. Berarti volume urin tersebut masih tergolong normal.
Bau yang tercium pada urin adalah sedikit bau toluen, karena digunakan pengawet toluen. Warna dari urin tersebut adalah kuning tua. Warna urin dapat berubah karena faktor makanan atau faktor patologik. Warna dari urin ini disebabkan oleh adanya zat warna urin yaitu urokrom yang terdiri dari uroflavin dan laktoflavin atau riboflavin dan uropterin. Warna urin dapat berubah karena pengaruh obat-obatan, misalnya karena meminum antibiotik atau dapat juga karena adanya penyakit hati. Bau urin yang pesing karena adanya ammonia yang disekresikan dalam urin.
Dalam menguji pH urin, digunakan indikator universal. Urin sampel memilki pH 6 (pH asam), dan dapat dikatakan normal karena umumnya pH urin dalam manusia bervariasi dari 4,5-8,0 (urin dapat bersifat asam, netral, atau basa). Ekskresi urin yang pada pH berbeda dari cairan tubuh, mempunyai dampak yang penting bagi elektrolit tubuh dan penghematan asam-basa.
Setelah dilakukan pengujian terhadap berat jenis urin, didapatkan angka 1,0058. Berat jenis urin yang normal berkisar antara 1,003-1,030 g/cm3, maka dapat disimpulkan bahwa urin yang diuji memiliki berat jenis yang termasuk dalam range yang normal. Berat jenis suatu larutan tergantung pada sifat maupun jumlah partikel terlarut yang ada di dalamnya. Berat jenis kadang-kadang masih diukur sebagai suatu indeks konsentrasi urin, disamping osmolalitas.

2. Jumlah zat padat total

Jumlah zat padat total normal dalam urin 24 jam kira-kira 150.8 g/l urin 24 jam. Sampel urin mengandung jumlah zat padat total 36,4 g/l urin. Jadi hasil ini dapat dikatakan menyimpang dari kisaran normal. Berat jenis suatu larutan tergantung pada sifat maupun jumlah partikel terlarut yang ada di dalamnya, karena itu berat jenis dapat digunakan untuk menentukan jumlah zat padat yang dikandung urin. Mungkin hasil yang menyimpang ini terjadi karena faktor asupan makanan yang masuk ke tubuh atau karena faktor kelainan pada tubuh. Hasil yang didapatkan memang tidak akurat karena hanya menghitung secara kasar saja jumlah zat padat total dalam urin.

3. Garam-garam ammonium

Pada percobaan adanya garam-garam ammonium, urin dibasakan terlebih dahulu menggunakan NaOH dan kemudian dipanaskan. Bau yang timbul akibat pemanasan adalah bau amoniak yang menandakan bahwa ammonium yang terkandung di dalam urin terlepas ke udara atau telah menguap. Berarti urin sampel mengandung garam amonium.
Reaksi utama pada tubuh yang menghasilkan NH4+ terjadi di dalam sel, yaitu perubahan glutamin menjadi glutamat yang dikatalisis oleh enzim glutaminase yang terdapat di dalam sel tubulus renalis. Glutamat dehidrogenase mengkatalisis perubahan glutamat menjadi α-ketoglutarat.

Glutamin → glutamat + NH4+
Glutamate → α-ketoglutarat + NH4+

Di dalam cairan interstisial dan urin tubulus, NH3 bergabung dengan H+ membentuk NH4+ yang menyingkirkan NH3 dan mempertahankan perbedaan konsentrasi yang memudahkan difusi NH3 keluar sel. Bila pH urin7,0 maka rasio NH3 : NH4+ = 1 : 100. Bila urin lebih asam, maka keseimbangan berubah lebih lanjut ke NH4+.
Proses NH3 disekresikan disebut difusi non-ionik. Salisilat dan sejumlah obat lain yang merupakan basa lemah atau asam lemah juga disekresi oleh difusi non ionik. Ion ammonium berasal dari makanan, obat-obatan dan hasil hidrolisa urea.
Mekanisme dari tubulus renalis dalam memproduksi ammonia sangat penting untuk mengatur keseimbangan asam basa dan penghematan kation, meningkat dengan nyata pada asidosis metabolik tetapi sebagian besar akan diekskresikan dalam bentuk urea yaitu komponen utama urin. Ammonia secara konstan diproduksi dalam jaringan tapi hanya ditemukan dalam jumlah kecil pada darah tepi yang dengan cepat dikeluarkan dari dalam darah oleh hati dan diubah menjadi glutamat, glutamin, ataupun urea (urin).
Dengan pereaksi nessler memberikan hasil negatif karena apabila dengan pereaksi nessler maka warna yang dihasilkan adalah warna merah.

4. Belerang dalam urin

 Belerang anorganik
Belerang anorganik merupakan bagian terbesar dari belerang teroksidasi (85-90 %) dan berasal terutama dari metabolisme protein. Pada percobaan ini, urin 24 jam direaksikan dengan HCl encer dan BaCl2. Maka akan terbentuk endapan putih yang menunjukkan adanya belerang anorganik, reaksi yang terjadi adalah :
BaCl2 + SO42- → BaSO4 ↓ + 2 Cl-

 Belerang etereal
Belerang etereal merupakan senyawaan asam sulfat dengan zat-zat organik. Sulfat etereal di dalam urin merupakan ester sulfat organik (R-O-SO3H) yang dibentuk di dalam hati dari fenol endogen dan eksogen, yang mencakup indol, kresol, esterogen, steroid lain, dan obat-obatan. Zat-zat organik tersebut berasal dari metabolisme protein atau pembusukan protein dalam lumen usus. Semuanya terurai pada pemanasan dengan asam. Jumlahnya 5-15 % dari belerang total urin. Dari percobaan tersebut, terbentuk endapan putih karena adanya endapan BaSO4 dari belerang etereal yang memiliki senyawa sulfat akan bereaksi dengan BaCl2.

 Belerang yang tak teroksidasi
Belerang tak teroksidasi merupakan senyawa yeng mempunyai gugus –SH, -S, -SCN, misalnya asam amino yang mengandung S (sistin), tiosulfat, tiosianat, sulfida, dsb. Jumlahnya adalah 5-25 % dari belerang total urin. Pada percobaan ini, kertas saring yang dibasahi dengan Pb-asetat menjadi berwarna hitam (hasil reaksi positif). Hal itu terjadi karena adanya gas hidrogen sulfida yang dilepaskan yang dapat diidentifikasi dari baunya yang khas atau dari menghitamnya kertas saring yang telah dibasahi larutan timbal asetat. Reaksi yang terjadi adalah :
S2- + 2 H+ → H2S ↑
H2S + Pb2+ → PbS ↓

5. Asam urat

Pada percobaan ini, digunakan tes mureksida yaitu dengan memanaskan sampai kering urin yang yang telah ditambah HNO3 pekat. Asam urat akan dioksidasi oleh HNO3 pekat membentuk asam dialurat dan aloksan. Setelah dingin, ditambahkan satu tetes ammonia encer (1 : 100), maka asam dialurat dan aloksan berkondensasi dengan amonia membentuk mureksida (ammonia purpurat) yang berwarna ungu kemerahan. Mekanisme reaksi yang terjadi adalah:

Bila urin setelah ditambahkan ammonia encer tetap berwarna merah, maka hal itu menyatakan adanya asam urat.
Pada percobaan, setelah ditambahkan HNO3 pekat dan dipanaskan hingga kering, urin membentuk warna kuning muda. Hal ini berarti bahwa pada urin yang diuji, tidak terdapat asam urat. Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan blanko berupa kristal asam urat. Setelah ditambahjann HNO3 pekat dan dipanaskan hingga kering, terbentuk warna kuning jingga. Seharusnya warna yang tebentuk adalah warna ungu kemerahan, tetapi warna yang terbentuk adalah kuning jingga, hal itu mungkin disebabkan karena kekurangketelitian praktikan dalam melakukan percobaan.

6. Kreatinin

Pada percobaan untuk mengetahui adanya kreatinin dalam urin, dilakukan reaksi Jaffe. Reaksi Jaffe berdasarkan pembentukan tautomer kreatin pikrat yang berwarna merah bila kreatinin direaksikan dengan larutan pikrat alkalis.

Warna ini akan berubah menjadi kuning apabila larutan diasamkan. Dari hasil percobaan, dipeoleh warna merah kecoklatan (jernih) dari penambahan urin dengan asam pikrat jenuh dan NaOH 10 %. Warna larutan pada salah satu tabung berubah menjadi kuning setelah ditambah HCl (tabung yang lain tidak ditambahkan HCl dan larutan tetap berwarna merah kecoklatan). Hal ini menunjukkan bahwa di dalam urin yang diuji, terdapat kreatinin.

7. Glukosa

Pereaksi Benedict yang mengandung kuprisulfat dalam suasana basa akan tereduksi oleh gula yang menpunyai gugus aldehid atau keton bebas (misal oleh glukosa), yang dibuktikan dengan terbentuknya kuprooksida berwarna merah. Reaksi :

Pada uji adanya glukosa dalam urin dilakukan tes Benedict, yaitu dengan mereaksikan urin dengan pereaksi Benedict yang telah dipanaskan dengan glukosa 0,3 %; 1 %; 2 %; 5 % dan urin tanpa penambahan apapun. Ternyata dari hasil pengujian diperoleh urin blanko tetap berwarna biru setelah ditambahkan larutan Benedict, untuk urin dengan penambahan glukosa 0,3 % akan memberi warna kuning kehijauan dengan endapan merah, untuk urin dengan penambahan glukosa 1 % akan memberi warna kuning kehijauan dengan adanya endapan merah yang lebih banyak dari yang 0,3 %, untuk urin dengan penambahan glukosa 2 % akan memberi warna jingga dengan endapan merah dari yang ditambahkan glukosa 1 % dan untuk urin dengan penambahan glukosa 5 % akan memberi warna jingga kemerahan dengan endapan merah yang lebih banyak.
Terbentuknya warna-warna tersebut, sesuai dengan konsentrasi glukosa dalam larutan. Makin besar kadar glukosa, makin banyak endapan oranye yang terbentuk. Tidak tebentuknya endapan oranye pada larutan glukosa konsentrasi rendah disebabkan karena baru sedikit glukosa yang mereduksi kuprisulfat dan kemudian tertutup warnanya dengan reagen Benedict yang berwarna biru. Tampak bahwa glukosa dengan kadar 5% baru memberikan endapan oranye paling banyak. Dari uji tersebut memberikan hasil bahwa urin yang diperiksa oleh praktikan tidak mengandung glukosa karena tidak memberi hasil positif terhadap tes Benedict. Berarti urin tersebut adalah urin yang normal.

Percobaan Urin Kuantitatif

1. Penetapan Kadar Kreatinin Urin (Folin)

Rs = 0, 249 nm
Ru = 0, 375 nm

Kadar kreatinin = 0,249/0,375 X 1500/1 X 1/1000
= 0,996 g/24jam

Kreatinin disintesis di dalam hati dari metionin, glisin, dan arginin. Dalam otot rangka kreatinin difosforilasi untuk membentuk fosforilkreatin yang merupakan simpanan tenaga penting bagi sintesis ATP. ATP yang terbentuk oleh glikolisis dan fosforilasi oksidatif bereaksi dengan kreatin untuk membentuk ADP dan banyak fosforilkreatin.
Urin Pria dewasa mengandung keratin 25mg/kg BB, berarti pada urin sample terdapat kreatinin sebanyak : 25 mg x 60 = 1500 mg (1,375g). Kreatinin dari hasil percobaan didapat kadar kreatinin sebanyak 0,996 g. jumlah kreatinin sampel masih dibawah kadar normal.
Kreatinin meninggi pada insufisiensi ginjal yang akut atau kronis, obstruksi traktus urinarius dan gangguan faal ginjal yang ditimbulkan oleh beberapa jenis obat. Bahan-bahan yang bukan kreatinin dapat bereaksi sehingga memberi hasil positif dengan metode alkalis pikrat (reaksi jaffe). Bahan-bahan tersebut adalah asetoasetat, aseton, β-Hidroksibutirat, α-ketoglutarat, piruvat, glukosa bilirubin, hemoglobin, urea dan asam urat.
Perbedaan hasil dapat disebabkan oleh beberapa factor seperti : usia, suku bangsa, jenis kelamin, lingkungan, sikap tubuh, makanan yang dimakan, obat-obatan dan kadar aktivitas.

2. Penetapan Kadar Klorida Urin (Schales dan Schales)

Dalam penetapan kadar Klorida dalam urin, digunakan cara Schales dan Schales. Urin dititrasi dengan merkuri nitrat dalam suasana asam. Ion-ion Cl- diikat oleh ion merkuri membentuk Hg Cl2 yang tidak terionisasi. Bila terdapat merkuri nitrat yang berlebihy, ion-ion merkuri ini akan bereaski dengan indicator difenilkarbazon membentuk warna ungu (Urin ditambahkan difenilkarbazon 0,1% lalu dititrasi dengan merkuri nitrat sampai berwarna ungu).
Dari percobaan terhadap urin 24 jam, diperoleh data sebagai berikut :
A = ml (jumlah merkuri nitrat untuk titrasi 5 ml larutan standard NaCl)
Sampel urin merkuri nitrat I = 15,50 ml
Sampel urin merkuri nitrat II = 15,55 ml
Kadar Klorida urin (meq/liter) = ml merkuri nitrat yang dipakai x 100/A
A = Jumlah ml merkuri nitrat untuk titrasi 5ml larutan standard NaCl.
Maka :

i. Kadar Klorida urin = 15,5 x 100/4,25
= 364,706 meq/liter
Kadar NaCl urin = 364,706 x 58,5
= 21335,301 mg/liter = 21,34 g/liter
ii. Kadar Klorida urin = 15,5 x 100/4,25
= 364,705 meq/liter
Kadar NaCl urin = 364,705 x 58,5
= 21335,242 mg/litrer = 21,34 g/liter

VI. KESIMPULAN

Dari percobaan urin ini, volume urin yang diperoleh adalam 1500 ml yang beraati volume ini masih dalam batas normal, urin tersebut memiliki bau amoniak, berwarna kuning tua, jernih, ber pH 6 memiliki BJ sebesar 1,0058 dan kandungan zat padat dalam urin 150.8 g / l.
Pada urin dormal terkandung garam-garam amonium , belerang anorganik, belerang yang tak teroksidasi, klorida dan kreatinin. Pada urin yang diuji oleh praktikan tidak terdapat asam urat maupun glukosa menandakan bahwa urin tersebut dalam keadaan normal. Pada percobaan kuantitatif diperoleh kadar kreatinin urin sebesar 0,996 g / 24 jam dan kadar NaCl rata-rata sebesar 21,34 g/liter.

DAFTAR PUSTAKA

Azizahwati, Penuntun Praktikum Biokimia, Laboratorium Biokimia Jurusan Farmasi FMIPA UI, 1994, Hal 36-44.
Ganong, W. F, Fisiologi Kedokteran edisi 14, Penerbit buku kedokteran, EGC, alih bahasa oleh dr. Petrus Andrianto.
Murray, K. Robert, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W.R, Biokimia Harper edisi 22, Penerbit bku kedokteran, EGC.

enzim

B. LANDASAN TEORI
Katalisator mempercepat reaksi kimia, mengalami perubahan selama reaksi, tetapi berubah kembali kepada keadaan semula setelah reaksi-reaksi selesai. Enzim merupakan biokatalisator yang bekerja spesifik. Aktivitas katalis yang dimiliki enzim merupakan alat ukur yang selektif dan sensitif terhadap aktivitas enzim. Aktivitas enzim dapat diamati dari sisa substrat, pH, suhu, dan indikator. Aktivitas enzim dapat diamati dari sisa substrat atau produk yang terbentuk. Faktor yang mempengaruhi pengukuran aktivitas enzim antara lain konsentrasi enzim dan substrat, suhu, pH, dan indikator. Aktivitas enzim meningkat bersamaan dengan peningkatan suhu, laju berbagai proses metabolisme akan naik sampai batasan suhu maksimal. Prinsip biologis utama adalah homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan keadaan normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktivitas banyak enzim. Adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan aktivitas enzim.
Kecepatan reaksi mula-mula meningkat dengan menaiknya suhu, hal ini disebabkan oleh peningkatan energi kinetik pada molekul-molekul yang bereaksi. Akan tetapi pada akhirnya energi kinetik enzim melampaui rintangan energi untuk memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik yang lemah, yang mempertahankan struktur sekunder-tersiernya. Pada suhu ini terjadi denaturasi enzim menunjukkan suhu optimal. Sebagian besar enzim suhu optimalnya berada diatas suhu dimana enzim itu berada.
Aktivitas enzim maksimal diperoleh pada pH optimal, untuk saliva (enzim amilase) pHnya 7. Bentuk kurva aktivitas pH ditentukan oleh denaturasi enzim (pada pH tinggi atau rendah) dan penambahan status bermuatan pada enzim dan atau substrat. Enzim dapat pula mengalami perubahan bentuk bila pH bervariasi. Gugus yang bermuatan yang jauh dari daerah terikat substrat diperlukan untuk mempertahankan struktur tersier-kuartener yang aktif. Dengan perubahan muatan pada gugus ini maka protein dapat terbuka sehingga aktivitasnya berubah.
Kecepatan awal suatu reaksi merupakan kecepatan yang diukur sebelum terbentuk produk yang cukup untuk memungkinkan suatu reaksi, kecepatan awal suatu reaksi yang dikatalisis enzim harus sebanding dengan konsentrasi enzim. Untuk menentukan kecepatan reaksi, sebenarnya pengaruh konsentrasi substratlah yang sangat berarti. Namun, konsentrasi substrat yang menunjukkan kecepatan maksimal aktivitas enzim akan mencerminkan jumlah enzim aktif yang ada.
Inhibitor non kompetitif irreversibel adalah suatu zat yang menghambat kerja enzim dengan cara berikatan dengan enzim tetapi bukan pada active sidenya, karena inhibitor tidak memiliki kesamaan dengan struktur substrat, maka peningkatan konsentrasi substrat umumnya tidak menghilangkan inhibitor tersebut. Banyak racun yang bekerja sebagai inhibitor non kompetitif irreversibel terhadap aktivitas enzim, antara lain ion logam berat, iodosetamida, dan zat-zat pengoksidatif.

C. ALAT DAN BAHAN
Alat:

1. Spektrofotometer
2. Tabung reaksi dan rak
3. Beaker glass
4. Erlenmeyer
5. Pipet volume
6. Termometer
7. Penangas air
8. Pipet tetes
9. Air es

Bahan:
1. Saliva
2. Larutan pati
3. Larutan Iodium
4. Air Suling
5. Larutan dengan pH 1, 3, 5, 7, 9 dan 11
6. Larutan Sublimat
7. Larutan Timbal Asetat

D. CARA KERJA DAN PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, ada beberapa prosedur yang dikerjakan, yang antara lain adalah sebagai berikut.
1. PENGARUH SUHU TERHADAP AKTIVITAS ENZIM
Bahan:
Liur sebagai sumber amylase. Tampunglah 2 ml liur dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang kering.
Pereaksi:
• Larutan pati (0,4 mg/ml)
• Larutan iodium
Cara:
a. Encerkan liur 10 kali dengan air suling.
b. Siapkan 6 pasang tabung reaksi yang bersih.
• Pasangan pertama ditempatkan dalam bejana es (00C)
• Pasangan kedua ditempatkan di rak tabung (suhu ruang)
• Pasangan ketiga ditempatkan di penangas air (370C)
• Pasangan keempat ditempatkan dalam bejana berisi air 600C
• Pasangan kelima ditempatkan dalam bejana berisi air 1000C
Tandai tabung satu dalam pasangan tabung dari tiap suhu tersebut dengan B (blanko), tabung dua dengan U (uji). Keenam tiap pasangan tabung dalam masing-masing suhu selama paling sedikit 5 menit.

c. Ke dalam tiap tabung, tanbahkan berturut-turut:
Larutan Tabung B Tabung U
• Larutan pati, keram pada tiap suhu paling sedikit 5 menit.
• Liur diencerkan (60X). Campur baik-baik, keram tepat 1menit
• Larutan iodium
• Air suling 1 ml

-

1 ml
8 ml 1 ml

20 µl

1 ml
8 ml
Segera baca densitas optik (DO) pada 680 nm. Hitung DO antara tabung B (dianggap DO = DO reaksi enzimatik pada t = 0) dengan tabung U dari tiap suhu.

Hasil Pengamatan:
Suhu (oC) DO B DO U Δ DO
0 0.144 0.117 0,027
25 0.136 0.037 0,099
Suhu ruang 0.111 0.017 0,094
37 0.130 0.015 0,115
60 0,137 0,029 0,108
100 0,141 0,118 0,023

Pembahasan:
Pada perubahan suhu, kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim mula-mula meningkat karena adanya peningkatan suhu. Energi kinetik akan meningkat pada kompleks enzim dan substrat yang bereaksi. Namun, peningkatan energi kinetik oleh peningkatan suhu mempunyai batas yang optimum. Jika batas tersebut terlewati, maka energi tersebut dapat memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik yang lemah yang mempertahankan struktur sekunder-tersiernya. Pada suhu ini, denaturasi yang disertai dengan penurunan aktivitas enzim sebagai katalis akan terjadi.
Suhu optimal enzim bergantung pada lamanya pengukuran kadar yang dipakai untuk menentukannya. Semakin lama suatu enzim dipertahankan pada suhu dimana strukturnya sedikit labil, maka semakin besar kemungkinan enzim tersebut mengalami denaturasi.
Dari hasil percobaan, pada suhu 0 oC, besarnya aktivitas enzim cukup signifikan besarnya. Seharusnya, pada suhu ini enzim dalam keadaan inaktif. Namun, ada sedikit kesalahan yang mungkin disebabkan karena kurang cepatnya praktikan mengisolasi enzim sehingga enzim telah bereaksi pada suhu kamar dan akibatnya ada sedikit aktivitas enzim yang terjadi. Belum lagi suhu kulkas yang tidak stabil karena sering dibuka dan ditutup oleh praktikan lain selama pengeraman. Sehingga kemungkinan besar temperatur yang diinginkan 0 oC tidak dapat tercapai. Seharusnya pada suhu 37 oC merupakan suhu dimana aktivitas enzim maksimal. Pada suhu ini seharusnya reaksi berlangsung paling cepat. Hal ini terjadi karena temperatur ini merupakan temperatur normal tubuh manusia (suhu optimal enzim amilase salivarius adalah 37 oC). Tetapi pada percobaan didapat kecepatan reaksi enzimatik tertinggi adalah pada suhu ruang. Hal ini mungkin disebabkan karena suhu di dalam ruangan lab lebih tinggi daripada suhu ruangan yang normal (28 oC) atau mungkin karena inkubasi pada suhu 37 oC kurang tepat atau tidak akurat. Pada interval suhu 0 oC-37 oC, kecepatan reaksi enzimatik mengalami kenaikan. Setelah melewati suhu optimum (37 oC), maka kecepatan reaksi enzimatik kembali menurun.

2. PENGARUH pH TERHADAP AKTIVITAS ENZIM
Bahan:
Liur sebagai sumber amilase. Tampunglah 2 ml liur dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang bersih dan kering.
Pereaksi:
• Larutan pati (0,4 mg/ml)
• Larutan iodium
• Larutan pH 1, 3, 5, 7, dan 9

Cara:
a. Encerkan liur 10 kali dengan tiap larutan berbagai pH tadi
b. Siapkan 6 pasang tabung reaksi yang bersih. Tandai tiap tabung dengan B (blanko) dan U (uji)
c. Ke dalam tiap tabung, lakukan prosedur berikut:
Larutan Tabung B Tabung U
• Larutan pati, keram pada tiap suhu 370C, paling sedikit 5 menit.
• Liur diencerkan 10x. Campur baik-baik, keram tepat 1menit
• Larutan iodium
• Air suling 1 ml

-

1 ml
8 ml 1 ml

20 µl

1 ml
8 ml

Segera baca DO pada 680 nm. Hitung ∆ DO antara tabung B (dianggap DO = DO reaksi enzimatik pada t = 0) dengan tabung U dari tiap pengenceran enzim.

Hasil Pengamatan:
pH DO B DO U Δ DO
1 0.064 0.127 -0,063
3 0.072 0.081 -0,009
5 0.093 0.112 -0,019
7 0.053 0.077 -0,024
9 0.036 0.122 -0,086
11 0,048 0,113 -0.065

Pembahasan:
Kondisi pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim melalui pengubahan stuktur atau pengubahan muatan pada residu yang berfungsi dalam pengikatan substrat atau katalis. Sebagai contoh, enzim bermuatan negatif (Enz-) bereaksi dengan substrat bermuatan positif (SH+) :
Enz- + SH+  EnzSH
Pada pH yang rendah, Enz- mengalami protonasi dan kehilangan muatan negatifnya (enzim dinetralisir) :
Enz- + H+  EnzH
Sedangkan, pada pH yang tinggi, SH+ mengalami ionisasi dan kehilangan muatan positifnya (substrat dinetralisir) :
SH+  S + H+
Karena (berdasarkan definisi) satu-satunya bentuk yang mengadakan interaksi adalah SH+ dan Enz-, nilai pH yang ekstrim (tinggi ataupun rendah) akan menurunkan kecepatan reaksi.
Pada kurva yang diperoleh melalui percobaan, dapat dilihat bahwa enzim amilase saliva memiliki pH optimal pada pH 7, karena pada pH ini diperoleh aktivitas enzim yang tinggi (kecepatan reaksi enzimatik tinggi). Umumnya, kecepatan reaksi enzimatik meningkat hingga mencapai pH optimal dan menurun setelah pH lebih besar dari pH optimal. Pada pH 1, 3 dan 5, aktivitas enzim masih ada, tetapi kecil (ditunjukkan oleh kecepatan reaksi enzimatik yang kecil pula). Hal ini disebabkan pada pH kurang dari 4, enzim amilase saliva menjadi tidak aktif. Pada pH 9 dan 11, aktivitas enzim menurun karena telah terlewati pH optimal dari enzim tersebut.

3. PENGARUH KADAR ENZIM TERHADAP AKTIVITAS ENZIM
Bahan:
Liur sebagai sumber amilase. Tampunglah 2 ml liur dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang bersih dan kering.
Pereaksi:
• Larutan pati (0,4 mg/dl)
• Larutan iodium
Cara:
a. Encerkan saliva 10x, 20x, 30x, 40x dan 50x dengan aquadest.
b. Siapkan 1 tabung reaksi yang bersih dan kering. Tandai dengan B (Blanko)
c. Siapkan 6 tabung reaksi yang bersih dan kering. Tandai tiap tabung dari setiap pasangan tabung dengan U (Uji).
d. Ke dalam setiap tabung, lakukan prosedur berikut:
Larutan Tabung B Tabung U
• Larutan pati, keram pada suhu 370C paling sedikit 5 menit
• Liur (tidak diencerkan, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x) campur baik-baik, keram tepat 1 menit
• Larutan iodium
• Aquadest 1 ml

-

1 ml
8 ml 1 ml

20 μl

1 ml
8 ml

e. Perhatikan warna larutan, lakukan terus pengenceran jika warna belum menyerupai blanko.
f. Segera baca DO pada 680 nm. Hitung ▲DO antara tabung B (dianggap DO = DO reaksi enzimatik pada t = 0) dengan tabung U dari tiap pengenceran enzim.
Hasil Pengamatan:
Pengenceran DO tb B DO tb U ▲DO / menit (v)
Tidak Diencerkan 0,559 - 0,346
10 x 0,097 0,116
20 x 0,036 0,177
30 x 0,017 0,196
40 x 0,026 0,187
50 x 0,014 0,199
80 x 0.017 0,196
100 x 0,020 0,193

Pembahasan:
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh kadar enzim. Aktivitas enzim dan kadar enzim memiliki hubungan perbandingan yang lurus. Hal ini berarti semakin besar kadar enzim, semakin besar aktivitas enzim dan semakin cepat reaksi yang dikatalisis enzim. Apabila kadar substrat tetap dan kadar enzim turun, maka kecepatan rekasi yang dikatalisis enzim akan menurun karena enzim yang tersedia tidak cukup banyak untuk bereaksi dengan substrat. Reaksi enzimatik yaitu:
k1 k2
Enz + S Enz-S Enz + P

Semakin banyak enzim yang berikatan dengan substrat, kecepatan reaksi semakin meningkat dan semakin banyak kompleks enzim-substrat yang terbentuk. Maka produk yang terbentuk pun semakin banyak.
Pada percobaan kali ini dibuat larutan enzim dengan berbagai macam konsentrasi untuk dapat membandingkan kerja enzim pada berbagai konsentrasi. Kadar enzim yang bervariasi dibuat dengan pengenceran dengan aquadest.
Pada hasil percobaan, aktivitas enzim tertinggi (kecepatan reaksi enzimatik tertinggi) seharusnya diperoleh pada kadar enzim terbesar, yaitu saat saliva tidak diencerkan. Hal ini disebabkan banyak enzim yang bereaksi dengan substrat sehingga kecepatan reaksi tinggi dan produk banyak yang dihasilkan. Semakin menurun kadar enzim, aktivitas enzim seharusnya semakin menurun.
Selanjutnya pada pengenceran 10x seharusnya diperoleh kecepatan reaksi enzimatik yang lebih kecil daripada tanpa pengenceran. Hal ini disebabkan jumlah enzim yang bereaksi dengan substrat berkurang sehingga aktivitas enzim pun menurun. Begitupun pada pengenceran seterusnya, seharusnya diperoleh bahwa semakin tinggi pengenceran (semakin encer), semakin menurun pula aktivitas enzim (kecepatan reaksi menurun)
Akan tetapi, percobaan yang dilakukan praktikan tidak sesuai dengan hasil yang seharusnya didapat. Terjadi penyimpangan-penyimpangan sehingga kecepatan reaksi enzimatik tidak berbanding lurus dengan kadar enzim melainkan kecepatan enzim bervariasi naik turun terhadap kadar enzim.
Penyimpangan tersebut dapat disebabkan oleh berbagai hal:
- Kurang teliti dalam melakukan pengenceran
- Kesalahan waktu atau suhu saat pengeraman
- Saliva sebagai sumber enzim telah dipengaruhi oleh zat warna atau kandungan dari permen karet yang digunakan untuk memicu pengeluaran saliva

4. PENGARUH INHIBITOR NON-KOMPETITIF IREVERSIBEL (LOGAM BERAT) DAN ANTISEPTIK TERHHADAP AKTIVITAS ENZIM
Bahan:
Liur sebagai sumber amilase. Tampunglah 2 ml liur dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang kering.
Peraksi:
• Larutan Pati ( 0,4 Mg / Ml )
• Larutan Iodium
• Larutan Sublimat ( Hgcl2 ), 1 gr/dl
• Larutan Timbal Asetat ( 1 gr/dl )
Cara:
a. Encerkan liur 10 x dengan air suling. Dalam tabung yang lain encerkan pula 10x dengan sublimat, larutan timbal asetat.
b. Siapkan 3 pasang tabung reaksi yang bersih. Tandai tiap tabung dengan b (blanko) dan u (uji).
c. Ke dalam tiap tabung, lakukan prosedur berikut :

No. Larutan tabung B tabung U
1.

2.

3.
4. Larutan pati, keram pada
Suhu 37˚c paling sedikit 5 menit
Liur diencerkan 10X dengan aquadest dan
dengan berbagai inhibitor atau antiseptik
Campur baik-baik, keram tepat 1 menit
Larutan iodium
Air suling 1 ml

-

1 ml
8 ml 1 ml

0,2 ml

1 ml
8 ml
Segera baca DO ( Densitas Optik ) pada 680 nm. Hitung ∆ DO antara tabung B ( dianggap DO = DO reaksi enzimatik pada t = 0 ) dengan tabung U dari tiap pengenceran enzim.

Hasil Pengamatan:
Pengenceran DO tb. B DO tb. U DO/menit (v)
Air suling
Sublimat Timbal asetat 0,009
0,014
0,011 0,001
0,011
0,033 0,008
0,003
-0,022

Pembahasan:
Inhibitor adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Penghambatan kerja enzim dibedakan menjadi penghambatan reversibel dan penghambatan ireversibel. Selain itu, ada pula inhibitor kompetitif dan inhibitor non-kompetitif.
Inhibitor kompetitif memiliki struktur kimia yang mirip dengan substrat dan mengikat enzim pada active site yang sama dengan substrat (tempat katalitik). Maka, inhibitor dan substrat akan bersaing untuk memperebutkan tempat-tempat pengikatan yang sama pada permukaan enzim. Struktur inhibitor non-kompetitif berikatan dengan enzim pada domain yang berbeda dari tempat pengikatan enzim-substrat. Inhibitor ini dapat bereaksi dengan kompleks enzim-substrat (karena tempat pengikatan enzim yang berbeda) untuk menghasilkan produk. Dalam kata lain inhibisi nonkompetitif tidak terdapat persaingan antara substrat dan inhibitor
Inhibitor nonkompetitif yang reversible menurunkan percapatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberiaan sejumlah tertentu enzim ( Vmaks yang lebih rendah ) tetapi biasanya tidak mempengaruhi Km., karena I dan S berikatan pada tempat yang berlainan. Pembentukan kompleks EnzInhibitor maupun EnzSubstrat dapat terjadi, karena EnzIS dapat terurai dan membentuk produk dengan kecepatan yang lebih lambat daripada penguraian EnzS, reaksi dapat diperlambat tetapi tidak akan berhenti.
Inhibitor non-kompetitif ireversibel yaitu inhibitor yang berikatan dengan enzim tidak pada active site-nya dan pengikatan inhibitor-enzim tidak dapat lepas lagi. Pada umumnya, terjadi pengikatan secara kovalen dengan gugusf ungsional dari enzim. Ion-ion logam berat, seperti Ag+ dan Hg2+, dapat mengurangi aktivitas enzim. Jika ion logam berat ini berikatan dengan enzim, enzim akan mengalami denaturasi.
Pada percobaan saliva diencerkan 80X dikarenakan saliva menunjukan aktifitas enzim substrat berlebih ( test dengan larutan iodium ) pada pengenceran 80X dengan aquadest. Aktivitas enzim tertinggi dicapai pada pengenceran dengan air suling. Sedangkan, pada pengenceran dengan larutan sublimat dan larutan timbal asetat, aktivitas enzim menurun karena sublimat dan timbal asetat menghambat enzim dengan berikatan pada substrat dan dapat mendenaturasi enzim. Inhibisi yang ditimbulkan oleh timbal asetat (Pb2+) lebih besar daripada yang ditimbulkan oleh sublima (Hg2+). Hal ini terlihat dari kecepatan reaksi enzimatik pada pengenceran dengan larutan timbal asetat paling kecil (aktivitas enzim sangat kecil).

E. KESIMPULAN
Dari beberapa percobaan yang dilakukan, maka dapat disimpulkan antara lain adalah sebagai berikut.
1. Kecepatan reaksi enzimatik akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu sampai batas optimum. Setelah melewati suhu optimum, maka kecepatan reaksi enzimatik akan kembali menurun. Suhu optimum enzim amilase salivarius adalah 37 oC, sama dengan suhu normal tubuh.
2. Kecepatan reaksi enzimatik akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu sampai batas optimum. Setelah melewati suhu optimum, maka kecepatan reaksi enzimatik akan kembali menurun. Suhu optimum enzim amilase yang terdapat pada saliva adalah 37 oC, sama dengan suhu normal tubuh.
3. Enzim memiliki aktivitas maksimal pada pH optimumnya (pH optimum enzim amilase saliva adalah 9. Penurunan atau kenaikan pH akan mempengaruhi aktivitas enzim.
4. Inhibitor logam berat dapat menyebabkan denaturasi enzim sehingga aktivitas enzim kecil sekali.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1998. Penunutun Praktikum Kimia Dasar Umum. Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.
Azizahwati. 2006. Penuntun Praktikum Biokimia. Laboratorium Biokimia Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.
Murray, Robert K. et. al. 2003. Biokimia Harper. Edisi 25. Jakarta: Penerbit buku kedokteran EGC.
Reynolds, James E.F. 1993. Martindale The Extra Pharmacopoeia. Edisi 30. London: The Pharmaceutical Press.
Suwandi, M. et. al. 1989. Kimia Organik . Edisi 1. Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

ASAM AMINO, PROTEIN, dan SUSU

I. Tujuan
1. Mengetahui cara identifikasi asam amino dan protein.
2. Mengetahui sifat dan reaksi dari berbagai asam amino.
3. Mengetahui perbedaan susu yang belum dipasteurisasi dengan susu yang sudah dipasteurisasi.

II. Teori Dasar
A. Asam Amino dan Protein
Protein merupakan molekul besar (berat molekulnya dapat sampai beberapa juta). Terdapat dalam seluruh sel tubuh. Protein tersusun atas kira-kira 20 macam asam amino yang berikatan satu sama lain dengan ikatan peptida yang dibentuk antara gugus karboksil asam amino dengan gugus amino dari asam amino berikutnya.
Protein pada umumnya diklasifikasikan atas daya larut dan komposisi kimianya. Berdasarkan komposisi kimianya, protein dibagi atas:
1. Simple Protein:
Merupakan protein yang hanya mengandung 1-alfa-asam amino atau derivatnya. Beberapa contoh Simple Protein antara lain: albumin, globulin, glutein, protamin, albuminoid, dan histon.
2. Conjugated Protein:
Merupakan protein yang bergabung dengan zat yang bukan protein. Zat yang bukan protein ini disebut gugus prostetik. Beberapa contoh Conjugated Protein antara lain: nukleoprotein, glikoprotein, fosfoprotein, lipoprotein, dan metalloprotein.
Asam amino dan protein secara umum mempunyai sifat-sifat fisik yang sama. Sebagai contoh, asam amino maupun protein mempunyai gugus asam dan basa. Kelarutan protein dalam air juga berbeda, tergantung dari banyaknya ion positif dan ion negative yang terdapat dalam protein. Protein bila dihidrolisis akan terurai menjadi beberapa jenis asam amino. Aktivitas biologis protein tergantung dari bentuk tiga dimensi asam-asam amino penyusunnya.
Destruksi atas bentuk tiga dimensi suatu protein disebut denaturasi. Bentuk tiga dimensi tergantung atas ikatan hydrogen, ikatan interionik (jembatan garam) dan ikatan disulfide. Suatu agent/zat-zat tertentu yang dapat berinteferensi dengan ikatan-ikatan tersebut dapat mendenaturasi suatu protein. Perubahan-perubahan yang terjadi pada protein akibat denaturasi antara lain adalah berkurangnya daya larut protein, hilangnya aktivitas protein (khusunya untuk enzim dan hormone), berubah atau hilangnya sifat antigen.
Asam amino dapat digolongkan menjadi 7 golongan atas dasar struktur rantai samping R.
Rumus umum asam amino:
COOH
|
H2N — C — H
|
R
Asam amino dapat digolongkan menjadi 7 golongan atas dasar struktur rantai samping R. Golongan tersebut adalah:
1. Asam amino dengan rantai samping alifatik, misalnya glisin, alanin, valin, leusin, dan isoleusin.
2. Asam amino dengan rantai samping yang mengandung gugus hidroksil, misalnya serin, treonin, dan tirosin.
3. Asam amino dengan rantai samping yang mengandung sulifur, misalnya sistein dan metionin.
4. Asam amino dengan rantai samping yang mengandung gugus asam atau amida, misalnya asam aspartat, asparagin, asam glutamat, dan glutamin.
5. Asam amino dengan rantai samping yang mengandung gugus basa, misalnya arginin, lisin, dan histidin.
6. Asam amino dengan rantai samping yang mengandung cincin aromatik, misalnya fenil alanin, tirosin, dan triptofan.
7. Asam amino lain, misalnya prolin dan 4-hidroksiprolin.
Asam amino terdapat dalam molekul protein. Akan tetapi, ada juga asam amino yang tidak terdapat dalam molekul protein, misalnya beta alanin, taurin, gamma amino butirat, ornitin, dan sitrulin.
Asam amino memiliki beberapa sifat yang khas. Sifat-sifat tersebut di antaranya adalah:
1. kristal putih yang larut dalam asam dan alkali kuat,
2. beberapa di antaranya mampunyai rasa manis, misalnya glisin, alanin, serin, dan prolin; rasa tawar, misalnya triptofan dan leusin; dan rasa pahit, misalnya arginin,
3. mempunyai atom C asimetris (kecuali glisin) sehingga mempunyai keaktifan optik,
4. bersifat amfoter, dan
5. pada pH isoelektrik, tidak bergerak dalam medan listrik.
Asam amino diperlukan oleh tubuh. Asam amino yang diperlukan oleh tubuh dibagi ke dalam 2 kelompok:
1. Asam amino esensial, yaitu asam amino yang tidak dapat disintesis oleh tubuh sehingga mutlak didapat dari makanan. Contohnya adalah triptofan, fenil alanin, lisin, treonin, valin, metionin, leusin, dan isoleusin.
2. Asam amino non-esensial, yaitu asam amino yang dapat disintesis oleh tubuh. Asam amino ini juga terdapat dalam makanan sebagai sumber nitrogen.

B. Susu
Susu merupakan makanan alami yang paling lengkap kandungan nutrisinya. Susu memiliki struktur yang sangat kompleks (terdiri lebih dari 100.000 molekul yang berbeda). Komposisi yang diperkirakan dalam susu adalah:
a. 87.3% air (sekitar 85,5%-88,7%)
b. 3,9% lemak susu (sekitar 2,4%-5,5%)
c. 8,8% padatan bukan lemak (sekitar 7,9%-10,0%), yaitu:
• protein 3,25% (¾ kasein)
• laktosa 4,6%
• mineral 0,65 % yaitu: Ca, sitrat, P, Mg, K, Na, Zn, Cl, Fe, Cu, sulfat, bikarbonat, dan banyak lainnya.
• asam 0,18% misalnya asam sitrat, format, asetat, laktat, oksalat.
• enzim-enzim, misalnya peroksidase, katalase, fosfatase, lipase.
• gas-gas, misalnya oksigen, nitrogen.
• vitamin-vitamin, misalnya vitamin A, C, D, tiamin, riboflavin dan lainnya.
Hal ini membuat penggunaan susu cocok untuk semua jenis umur dan susu dapat memproduksi makanan penting, seperti mentega dan keju. Susu mengandung karbohidrat, protein, vitamin, mineral dan lain-lain. Kekurangan dari susu adalah kandungannya yang rendah terhadap zat besi, tembaga, vitamin C dan vitamin D.
Perbedaan antara susu manusia dengan susu sapi adalah pada kandungan protein dan abu yang lebih tinggi pada susu sapi dan kandungan karbohidrat yang lebih tinggi pada susu manusia. Berikut ini adalah komposisi dari susu sapi:
• 88% air
• 3,3% protein
• 3,3% lemak
• 4,7% karbohidrat
• 0,7% abu
Modifikasi dari susu sapi untuk nutrisi bayi disempurnakan dengan pengenceran dengan air untuk menurunkan kadar abu dan proteinnya, serta untuk meningkatkan laktosa atau karbohidrat lain sejumlah kira-kira susu manusia. Penampilan susu yang putih dapat disebabkan oleh lemak yang teremulsi atau karena adanya garam kalsium dari kasein. Warna kuning yang terbentuk disebabkan oleh pigmen karotenoid, contohnya karoten. Susu segar memiliki pH antara 6,6 sampai 6,8. Susu yang tidak steril capat menjadi asam dan menunjukkan adanya fermentasi oleh mikroorganisme.
Distribusi dari konstituen inorganik sangat mirip antara susu manusia dan susu sapi. Hal yang penting untuk diperhatiakn adalah kandungan yang tinggi dari kalsium, fosfor, kalium, magnesium dan klor. Susu mungkin merupakan sumber kalsium dan fosfor yang ideal dalam nutrisi. Kedua elemen ini penting untuk semua sel dan diperlukan dalam jumlah yang besar untuk pembentukan tulang dan gigi. Aktivitas sekresi dan kelenjar mammae mencapai perbedaan yang besar pada konsentrasi konstituen inorganik dalam darah dan susu. Rasio molar susu dibandingkan dengan konsentrasi darah menunjukkan bahwa kandungan natrium dan flor dari susu jelas lebih rendah dari plasma, dimana kandungan kalsium, kalium, magnesium, dan fosfat sangat tinggi.
Susu murni mentah mengandung beberapa enzim diantaranya katalase, dehidrogenase dan peroksidase. Bila susu dipasteurisasi, maka enzim-enzim tersebut akan rusak. Untuk enzim dehidrogenase, dapat digunakan tes Schardinger yang berdasarkan reduksi biru metilen oleh dehidrogenase membentuk leukobirumetilen yang tidak berwarna. Hidrogen untuk reaksi ini diperoleh dari formalin.

III. Alat dan Bahan
Alat : Tabung reaksi dan rak Penangas air
Indikator universal Beaker glass
Kertas saring Kaca arloji
Pembakar spiritus Batang pengaduk
Pipet tetes Gelas ukur
Corong Kaki tiga dan kasa

Bahan : Larutan albumin 2 % Serbuk albumin
Larutan putih telur Larutan kasein2%
Larutan fenol 2% Larutan (NH4)2SO4
Susu murni Pereaksi Millon
Pereaksi Hopkins-Cole Pereaksi ninhidrin0,1%
Pereaksi Guaiac H2SO4 pekat
Larutan NaOH 10% Larutan CuSO4
Urea HNO3 pekat
NaOH atau NH4OH pekat Etanol 95%
HgCl2 2% Pb-asetat 2%
FeCl3 2% Larutan H2O2 3%
Larutan eter Larutan eter-etanol
Indikator pp dan mm Biru metilen 0,02%
Formaldehid 0,4% Aquadest

IV. Cara Kerja
4.1. Test Millon
Reaksi ini disebabkan oleh derivat-derivat monofenol seperti tirosin. Pereaksi yang digunakan adalah larutan ion merkuri/merkuro dalam asam nitrat/nitrit. Warna merah yang terbentuk mungkin disebabkan oleh garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi.
Metode :
1. tambahkan 5 tetes pereaksi Millon ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 3 ml albumin, kasein, fenol 2% dan putih telur.
2. panaskan campuran dengan hati-hati.
3. warna merah menyatakan hasil positif, jika reagen yang digunakan terlalu banyak maka warna akan hilang dengan pemanasan.

4.2. Test Hopkins-Cole
Pereaksi yang digunakan mengandung asam diglioksilat. Triptofan berkondensasi dengan aldehida, dan dengan asam pekat membentuk kompleks berwarna dari jenis asam 2,3,4,5-tetrahidro-karbolin-4-karboksilat.
Metode :
1. campurlah 2 ml larutan albumin 2%, kasein, dan putih telur dengan larutan Hopkins-Cole.
2. tambahkan dengan hati-hati melalui dinding tabung asam sulfat pekat.
3. amati warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan.

4.3. Test Ninhidrin
Semua asam amino alfa bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan NH3 dan CO2. Disamping itu, terbentuk kompleks berwarna biru yang disebabkan oleh 2 molekul ninhidrin yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. Garam-garam ammonium, amina, peptida, dan protein juga bereaksi tetapi tanpa melepaskan CO2 dan NH3.
Metode :
1. dalam tabung reaksi yang berisi larutan (NH4)2SO4, albumin 2%, kasein 2%, dan putih telur ditambah 0,5 ml larutan Ninhidrin 0,1%.
2. letakkan pada pemanas air mendidih selama 10 menit.

4.4. Test Biuret
Merupakan test umum yang baik untuk protein. Warna yang terbentuk kemungkinan berasal dari kompleks antara ion Cu++ dengan gugus –CO dan –NH ikatan peptida dalam suatu alkalis.
Metode :
1. campurlah 2 ml larutan albumin 2% dengan 2 ml NaOH 10% dan tambahkan setetes larutan CuSO4. campurlah dengan baik, jika belum terbentuk warna tambahkan lagi setetes atau 2 tetes CuSO4. ulangi test ini dengan larutan kasein dan putih telur.
2. isilah tabung reaksi dengan sedikit urea, panaskan di atas api kecil sehingga zat tersebut mencair dan terbentuk gelembung-gelembung gas (hati-hati jangan sampai mengarang) perhatikan bau gas yang terbentuk. Larutkan isi tabung tersebut dengan air dan lakukan test Biuret seperti di atas.

4.5. Test Xanthoprotein
Reaksi ini berdasarkan nitrasi inti benzen yang terdapat dalam molekul protein. Senyawa nitro yang terbentuk berwarna kuning dan dalam lingkungan alkalis ia terionisasi dengan bebas dan warnanya menjadi lebih tua atau menjadi jingga.
Metode :
1. campurlah 2 ml larutan albumin 2% dengan 1 ml HNO3 pekat. Perhatikan terbentuknya endapan berwarna putih.
2. panaskan hati-hati, endapan akan larut kembali dan larutan tersebut akan berubah menjadi kuning.
3. dinginkan di bawah kran dan dengan hati-hati (tetes demi tetes) tambahkan dengan larutan alkali pekat (NaOH atau NH4OH).
4. ulangi percobaan larutan kasein, larutan fenol 2%, dan larutan putih telur.

4.6. Pengaruh Logam Berat
Metode :
1. ke dalam 3 ml larutan albumin 2% da larutan putih telur ditambahkan 5 tetes larutan HgCl2 2%.
2. ulangi percobaan dengan menggunakan Pb-asetat 2% dan FeCl3 2%.

4.7. Koagulasi Protein dengan Pemanasan
Metode :
1. isilah 2 tabung reaksi dengan 50 mg serbuk albumin.
2. tambahkan 5 ml air pada salh satu tabung.
3. letakkan kedua tabung pada pemanas air mendidih dengan sering-sering mengocoknya selama 15 menit, angkat keduanya, dinginkan dan tambahkan dengan 5 ml air pada tabung yang berisi albumin kering.
4. kocok keduanya lalu saring, pada filtrat lakukan test Biuret.

4.8. Reaksi Susu
Pereaksi pH susu dengan fnolftalein, metil merah dan indikator universal.

4.9. Test Protein
Lakukan test Millon dan Biuret terhadap sejumlah kecil susu.

4.10. Pembentukan Film (selaput)
Metode :
1. Panaskan 25 ml susu murni hingga mendidih di dalam gelas kimia yang terbuka.
2. Ambil selaput yang terbentuk di atas permukaan susu, lakukan pemeriksaan dengan Millon dan Biuret.
3. Dinginkan dan ulangi pemanasan.

4.11. Membedakan Suhu Mentah dan Susu yang Telah Dipasteurisasi
Susu murni mentah mengandung beberapa enzim, diantaranya yaitu katalase, dehidrogenase,dan peroksidase. Bila susu dipasteurisasi, enzim-enzim tersebut menjadi rusak.
Metode :
1. Test Guaiac (untuk katalase)
Campurlah 2 ml susu mentah dengan 8 ml air. Bagilah larutan menjadi 2 bagian, masukkan masing-masing bagian ke dalam tabung reaksi yang diberi tanda a dan b. Panaskan tabung a hingga mendidih kemudian dinginkan. Kedalam dua tabung tadi ditambahkan 10 tetes larutan guaiac dalam alkohol dan beberapa tetes H2O2 3%, campur baik-baik dan panaskan dalam penangas air 37C.

2. Test Schardinger (untuk dehidrogenase)
Test ini berdasarkan reduksi biru metilen oleh dehidrogenase membentuk leukobirumetilen yang tidak berwarna. Hidrogen untuk reduksi ini diperoleh dari formaldehid.
Metode : isilah sebuah tabung reaksi dengan 5 ml susu mentah dan tabung lain dengan 5 ml susu yang telah dipasteurisasikan. Tambahkan pada masing-masing tabung 1 ml larutan biru-metilen 0,02% dan 1 ml larutan formaldehid 0,4%. Campur, dengan baik dan panaskan pada penangas air pada suhu 60-65C (jaga suhu jangan sampai melebihi 67C).

4.12. Pembuatan Kasein
Panaskan 50 ml susu dalam penangas air pada suhu 40C. Tambahkan tetes demi tetes 1 ml asam asetat glacial sambil diaduk sehingga semua kasein mengendap. Saring endapannya dengan kain dan hilangkan airnya. Suspensikan endapan dalam 25 ml etanol 95%, dekantasi dan buang supernatant, ulangi dengan 25 ml larutan eter-etanol 1:1. gunakan pula 25 ml larutan eter-etanol untuk memindahkan kasein ke dalam corong Buchner, cuci dengan 25 ml eter, keringkan endapan tersebut di atas kaca arloji.
1. periksalah daya larut kasein dalam NaCl 10%; NaOH 0,1 N; HCl 0,2 N; Na2CO3 0,5%; Ca(OH)2 jenuh.
2. lakukan test-test Biuret, Millon, Xanthoprotein, dan Hopkins Cole untuk protein.

V. Pengamatan dan Pembahasan

5.1. Test Millon
Tabung Hasil Pengamatan Keterangan
Albumin Merah Tua Merah tua berbentuk larutan, ada gumpalan pink di bagian bawah
Kasein Merah Gumpalan merah muda
Fenol 2% Tidak terbentuk warna merah Hasil negatif
Putih Telur Merah Tua Ada gumpalan putih dan merah tua tidak bercampur (semuanya gumpalan)

Jawaban Pertanyaan
1. Jika garam merkuri ditambahkan ke dalam protein akan terbentuk warna merah.
2. Larutan protein terkoagulasi karena protein mengalami destruksi bentuk dimensi dari rantai polipeptida yang ikatannya akan pecah tanpa mengakibatkan pemecahan ikatan kovalen dari ikatan peptidanya.

Pembahasan
Baik Albumin, Kasein, maupun putih telur memberikan hasil (+) terhadap test Millon. Hal ini dikarenakan pada Albumin, Kasein, dan putih telur mengandung derivat monofenol.
Reaksi ini didasari bahwa bila suatu protein ditambahkan garam merkuri, maka akan terjadi koagulasi. Protein dapat terkoagulasi karena protein mengalami destruksi bentuk tiga dimensi dari rantai polipeptida yang ikatannya akan pecah tanpa mengakibatkan pemecahan ikatan kovalen dari ikatan peptidanya. Dasar inilah yang menjelaskan mengapa fenol yang dalam hal ini merupakan golongan non protein, tidak mengalami koagulasi sehingga memberikan hasil yang negatif.

5.2. Test Hopkins-Cole
Tabung Hasil Pengamatan
Albumin 2 % Cincin ungu, namun tidak terlalu ungu,bagian atas putih pekat
Kasein Cincin ungu, bagian atas putih keruh
Putih Telur Cincin ungu, bagian atas kuning

Jawaban Pertanyaan
1. Yang tidak memberikan hasil uji positif : Tidak ada, karena semua mengandung triptofan.

Pembahasan
Pereaksi Hopkins-Cole terdiri dari asam glioksilat (CHO.COOH) dalam H2SO4 (p). Triptofan diduga berkondensasi dengan aldehida ini,dan dengan asam pekat membentuk kompleks berwarna dari jenis asam 2,3,4,5-tetrahidro-β-karbolin-4-karboksilat.
Test ini berhasil bila terdapat oksidator kuat seperti nitrat dan klorat. Asam sulfat yang digunakan harus sangat murni yang berarti tidak mengandung bahan-bahan yang bertindak sebagai oksidator.
Hasil positif (membentuk cincin ungu) diberikan oleh ketiga larutan uji, yaitu albumin, kasein, dan putih telur. Hasil tersebut menunjukkan bahwa dalam ketiga zat terdapat asam amino triptofan. Warna ungu diberikan oleh gugus indol yang terdapat dalam triptofan.
Reaksi dari test Hopkins-Cole yaitu:

5.3. Test Ninhidrin
Tabung Hasil Pengamatan
(NH4)2SO4 Bening
Albumin 2 % Biru keunguan
Kasein 0,2 % Ungu muda, ada endapan
Putih Telur Lapisan atas berwarna ungu, lapisan bawah berwarna putih

Jawaban Pertanyaan
1. Terbentuk warna : ungu atau biru
2. Gugus yang memberikan uji positif : aldehida dengan satu atom C lebih rendah

Pembahasan
Reaksi ini merupakan reaksi deaminasi serin dekarboksilasi dan menghasilkan gas CO2, gas NH3, hidrindatin, dan suatu aldehid yang mempunyai jumlah atom C kurang satu dari asam amino semula. Gas NH3 yang dibebaskan dan hidrindantin akan bereaksi kembali dengan ninhidrin dan menghasilkan suatu senyawa kompleks diketohidrindilena-diketohidrinamina yang berwarna ungu atau biru. Semua alfa amino, peptida, dan protein akan memberi warna ungu atau biru dengan ninhidrida. Disamping asam alfa amino, senyawa amina yang lain juga akan bereaksi dengan ninhidrin dan menghasilkan senyawa yang berwarna biru. Perbedaannya reaksi yang terakhir ini tidak menghasilkan gas CO2.
Hasil pengamatan oleh kelompok kami menunjukkan bahwa albumin, kasein, dan putih telur memberi hasil positif, yang berarti ketiga zat tersebut mengandung asam amino α. Sedangkan (NH4)2SO4 memberi hasil negatif.

5.4. Test Biuret
Tabung Hasil Pengamatan
Albumin 2 % Larutan warna ungu
Kasein 2 % Larutan warna ungu agak kebiruan
Putih Telur Larutan warna ungu

Jawaban Pertanyaan
1. Terbentuk warna : ungu
2. Kelebihan CuSO4 harus dihindari karena :
• Cu merupakan logam berat. Jika penggunaannya terlalu banyak maka albumin akan terdenaturasi membentuk koagulan.
• Pada suasana alkalis akan terbentuk Cu(OH)2 dari reaksi :
Cu2+ + 2OH-  Cu(OH)2 (ungu)
Cu2+ berwarna biru intensif, jika berlebihan akan mengakibatkan warna ungu terkalahkan sehingga hasilnya negatif
3. Reaksi pembentukan Biuret dari urea

CO(NH2)2 + NaOH + CuSO4 kompleks Cu

Pembahasan
Berdasarkan hasil percobaan, albumin, kasein, dan putih telur memberikan warna ungu (hasil positif). Warna ungu yang terbentuk adalah senyawa biuret. Oleh karena itu dapat dikatakan bahwa albumin, kasein, dan putih telur memiliki paling sedikit dua ikatan peptida.
Urea bukan merupakan protein, namun karena urea mengandung gugus –NH2 (amin) yang mempunyai kesamaan dengan gugus protein sehingga membentuk warna ungu sebagai hasil reaksi antara Cu2+ dengan –NH. Oleh karena itu urea memberikan hasil positif pada uji biuret. Pada pemanasan urea terbentuk gelembung gas dan mengeluarkan bau ammonia yang sangat menyengat.

5.5. Test Xanthoprotein

Tabung Hasil Pengamatan
Penambahan HNO3 Dipanaskan 25 menit Pendinginan, lalu penambahan NH4OH Keterangan
Larutan atas Warna orange setelah pengocokan Larutan bawah
Kasein 2% Ada endapan kuning, larutan kuning Kuning muda keruh Orange jernih ++ ++ Kuning +
Putih Telur Gumpalan kuning putih Kuning tua keruh Orange jernih +++ ++++ Kuning ++ Cincin orange kemerahan
Fenol Larutan merah coklat Hijau muda, ada gumpalan kuning Orange kemerahan +++ Hijau Muda Tidak ada cincin
Albumin 2% Gumpalan putih pada bagian atas, larutan bagian bawah berwarna kuning muda Kuning keputihan Kuning + + Kuning keputihan

Jawaban Pertanyaan
1. Pada test ini yang terjadi adalah terbentuknya senyawa nitro yang berwarna kuning, dan dalam lingkungan alkalis akan terionisasi dengan bebas dan warnanya berubah menjadi jingga.

Pembahasan
Pereaksi Xanthoprotein terdiri dari HNO3 pekat panas. Reaksi ini digunakan untuk asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. Reaksi ini berdasarkan nitro inti benzene yang terdapat dalam molekul protein. Senyawa nitro yang terbentuk berwarna kuning dan dalam lingkungan alkalis akan terionisasi dengan bebas dan warnanya menjadi lebih tua atau menjadi jingga
Berdasarkan hasil percobaan, albumin, kasein, putih telur, dan fenol memberikan hasil positif (terbentuk warna yang tadinya kuning menjadi jingga). Hal ini menunjukkan bahwa keempat larutan uji tersebut memiliki inti benzene. Reaksi ini berdasarkan nitrasi inti benzene yang terdapat dalam molekul protein. Untuk fenol, reaksi ini positif karena pada fenol terdapat inti benzen.

5.6. Pengaruh Logam Berat
Tabung Hasil Pengamatan
HgCl2 2 % Pb Asetat 2 % FeCl3 2%
Albumin 2 % Gumpalan di bawah Menggumpal di bawah Tidak ada gumpalan
Putih Telur Gumpalan di atas Gumpalan diatas Tidak bercampur dengan putih telur

Jawaban Pertanyaan
1. Hasil yang terbentuk : albumin akan membentuk gumpalan dengan adanya logam berat.
2. Putih telur digunakan sebagai antidotum terhadap keracunan logam berat karena putih telur mengandung albumin, sehingga apabila tubuh keracunan logam berat maka ion logam berat tersebut akan bereaksi dengan albumin membentuk koagulan sehingga logam berat tersebut tidak akan mengganggu atau merusak aktivitas enzim lain di dalam tubuh.

Pembahasan
Garam-garam dari logam berat seperti Hg2+, Ag+ dan Pb2+ dapat berikatan dengan gugus –SH dari protein. Disamping itu dapat membentuk ikatan yang sangat kuat dengan gugus –COO- dari asam aspartat dan asam glutamate yang terdapat dalam molekul protein pecah sehingga proteinnya sendiri akan mengendap. Dengan terjadinya pengendapan atau disebut juga koagulasi, protein mengalami perubahan konformasi serta posisinya sehingga aktivitasnya berkurang atau kemampuannya untuk menunjang aktivitas organ tubuh tertentu akan hilang. Berdasarkan hasil percobaan, pada albumin dan putih telur dengan logam Hg dan Pb akan terjadi koagulasi, tapi dengan logam Fe tidak terjadi koagulasi.

5.7. Koagulasi Protein dengan Pemanasan
Tabung Hasil Pengamatan
1 Ada Koagulai protein warna biru; larutan berwarna ungu lebih muda
2 Tidak ada koagulasi; larutan berwarna ungu

Jawaban Pertanyaan
1. Pada koagulasi protein dengan pemanasan diperlukan air.

Pembahasan
Koagulasi adalah proses penggumpalan, sedangkan denaturasi adalah inaktivasi protein.
Pemberian energi berupa panas akan memutuskan ikatan hidrogen dan akan menyebabkan terjadinya penggumpalan protein. Penambahan air pada koagulasi protein dengan pemanasan diperlukan air karena jika tidak ada air maka koagulasi protein tidak akan terjadi. Protein yang tanpa air dengan pemanasan akan terjadi denaturasi tetapi tidak terjadi koagulasi. Denaturasi tidak selalu disertai dengan koagulasi.
Serbuk albumin yang ditambah air sebelum pemanasan sudah mengalami koagulasi, namun pada serbuk albumin yang tidak ditambahkan air, koagulasi tidak terjadi walaupun sudah dipanaskan. Baru setelah ditambah air, koagulasi dapat terjadi. Dari serbuk albumin yang ditambahkan air, setelah ditambahkan pereaksi biuret terbentuk warna ungu yang lebih muda dibandingkan dengan albumin yang dipanaskan tanpa air.

5.8. Reaksi Susu
Indikator Pengamatan
Phenolphtalein Tetap Putih
Metil Merah Jingga
Indikator Universal 7 (netral)

Pembahasan
Pada pemeriksaan pH dengan menggunakan fenolftalein, setelah diberi pereaksi fenolftalein 3 tetes, warna susu tidak berubah (putih). Apabila dilihat dari trayek pH fenolftalein yang berkisar antara pH 8,3-10, dengan perubahan warna dari tidak berwarna sampai ungu, maka dapat disimpulkam bahwa pH susu berada di antara < 8,3.
Pada pemeriksaan pH dengan menggunakan metil merah, diperoleh warna susu yang berubah menjadi jingga. Jika dilihat dari rentang pH metil merah yang berkisar antara 4,2-6,3 dengan warna merah sampai kuning, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa pH susu lebih dari 6,3.
Pada pemeriksaan dengan menggunakan indikator universal, didapat hasil bahwa pH susu adalah 7.

5.9. Test Protein pada Susu
Uji Pengamatan Kesimpulan
Test Millon Terbentuk gumpalan warna merah muda +
Test Biuret Terbentuk warna ungu +

Pembahasan
Susu mengandung protein. Hal ini terlihat dari hasil test Biuret yang menunjukkan hasil positif berupa terbentuknya larutan berwarna ungu. Test Biuret digunakan untuk reaksi umum protein, sedangkan untuk test Millon menunjukkan hasil positif berupa terbentuknya gumpalan berwarna merah. Test Millon digunakan untuk menunjukkan asam amino, bahwa asam amino yang memberikan hasil positif adalah tirosin. Sehingga dapat disimpulkan bahwa asam amino yang terdapat dalam susu adalaeh tirosin.

5.10. Pembentukan Film (selaput)
Perlakuan Hasil Pengamatan
Pemanasan Terbentuk selaput
Test Millon Warna merah
Test Biuret Warna ungu
Didinginkan, kemudian dipanaskan kembali Tidak terbentuk selaput

Jawaban Pertanyaan
1. Yang membentuk selaput : protein
2. Pada pemanasan selanjutnya tidak terbentuk selaput.

Pembahasan
Pada pemanasan susu murni hingga mendidih, akan dapat kita lihat pada bagian atas permukaan larutan susu adanya selaput (seperti film tipis). Selaput kemudian dites dengan peraksi Millon dan ternyata diperoleh hasil yang positif dengan adanya endapan berwarna merah. Hal ini menunjukkan bahwa pada selaput yang terbentuk mengandung asam amino tirosin. Sedangkan, pada pengetesan dengan Biuret, hasil yang diperoleh juga positif yaitu dengan adanya warna larutan ungu, yang berarti bahwa selaput mengandung protein. Setelah dididihkan ulang, ternyata selaput kembali terbentuk pada permukaan cairan susu.
Selaput terbentuk dari protein susu (kasein) yang menggumpal akibat adanya pemanasan. Pemanasan mengakibatkan denaturasi protein sehingga mengakibatkan koagulasi protein, yang ditandai dengan munculnya selaput tipis pada permukaan atas susu yang dididihkan.
Pada pemanasan kembali, tidak terbentuk selaput. Hal ini disebabkan karena suadah tidak ada lagi protein yang tertinggal setelah pemanasan.

5.11. Membedakan Susu Mentah dan Susu yang Telah Dipasteurisasi
1. Test Guaiac
Larutan Uji Pengamatan Kesimpulan
Susu mentah Terbentuk warna jingga +
Susu dipasteurisasi Warna tetap putih -

Jawaban Pertanyaan
Yang terlihat dalam test Guaiac ini adalah tabung yang berisi susu yang telah dipasteurisasi memberikan hasil negatif (warna larutan putih), sedangkan tabung yang berisi susu mentah memberikan hasil positif (warna larutan menjadi jingga). Hal ini berarti enzim katalse terdapat dalam susu mentah dan tidak terdapat dalam susu yang telah dipasteurisasi.

Pembahasan
Test Guaiac akan memberikan hasil positif pada enzim katalase. Enzim katalase terdapat pada susu yang belum dipasteurisasi. Reaksi yang dikatalisis oleh enzim katalase adalah :
H2O2 katalase H2O + O2
Gas O2 yang terbentuk akan mengubah larutan guaiac dalam alkohol menjadi berwarna jingga. Pada hasil percobaan, tabung yang berisi susu mentah memberikan hasil positif terhadap test guaiac karena enzim katalase terdapat dalam susu mentah. Sedangkan tabung yang berisi susu yang telah dipasteurisasi tetap berwarna putih karena dalam susu yang telah dipasteurisasi, tidak terdapat lagi enzim katalase karena enzim itu telah rusak saat pemanasan (pasteurisasi).
Enzim katalase berperan penting dalam tubuh untuk mengubah senyawa H2O2 yang berbahaya, yang dapat mengubah Fe2+ menjadi Fe3+ yang dapat menyebabkan tidak terbentuknya ATP melalui respirasi.

2. Test Schardinger
Larutan Uji Pengamatan Kesimpulan
Susu mentah Warna biru menjadi putih +
Susu dipasteurisasi Tetap warna biru -

Jawaban Pertanyaan
a. Yang terlihat : pada susu yang masih murni (mentah) masih terdapat aktivitas dari enzim dehidrogenase, sehingga pada saat pemanasan dapat mereduksi metilen biru (warna biru berubah menjadi putih). Sedangkan pada susu yang telah dipasteurisasi, susu tersebut kehilangan aktivitas enzim dehidrogenase yang mengakibatkan susu tersebut tidak dapat mereduksi metilen biru (warna biru tidak berubah).

b. Di bagian atas campuran terlihat warna biru karena biru metilen yang sudah direduksi oleh enzim dehidrogenase menjadi leukobirumetilen mengalami oksidasi kembali oleh udara sehingga menjadi biru metilen kembali (warna larutan susu akan menjadi biru kembali).

Pembahasan
Test ini berdasarkan reduksi biru metilen oleh enzim dehidrogenase pembentuk leukobirumetilen (MbH2) yang tidak berwarna. Hidrogen yang diperoleh dari formaldehid digunakan untuk mereduksi. Atom H yang terjadi oleh enzimnya segera diikat pada oksigen atau atom H diikat oleh akseptor birumetilen (Mb), maka terjadilah air atau leukobirumetilen yang tidak berwarna. Hanya susu murni (yang tidak dipanaskan) akan memberikan hasil positif terhadap reaksi tersebut (karena enzim dehidrogensenya rusak). Oleh karena itu, reaksi ini dapat digunakan untuk menemukan kesegaran susu murni. Pada susu yang telah dipasteurisasi, enzim dehidrogenase telah rusak sehingga tidak dapat mereduksi birumetilen dan warna larutan tetap biru.

5.12. Pembuatan Kasein
1. Daya Larut Kasein
Larutan Daya Larut
NaCl 10 % Tidak larut
NaOH 0,1 N Larut
HCl 0,2 N Praktis tidak larut
Na2CO3 0,5 % Larut
Ca(OH)2 Larut

Pembahasan
Pada larutan NaOH 0,1 N dan Na2CO3 0,5 % kasein larut dengan pengocokan serta pengadukan yang sangat kuat. Pada larutan Ca(OH)2 kasein agak sukar larut, ditandai dengan keruhnya larutan yang terbentuk. Sedangkan pada NaCl 10 % dan HCl 0,2 N kasein tidak larut, ditandai dengan tetap menggumpal pada larutan.

2. Uji Protein
Uji Hasil Pengamatan
Test Millon Endapan jingga kemerahan
Test Biuret Larutan ungu, ada endapan biru
Test Xantoprotein Larutan atas kuning, bagian bawah terbentuk lapisan putih
Test Hopkins-Cole Terbentuk cincin ungu

Pembahasan
Pada tes Millon, hasil yang diberikan adalah positif dengan adanya warna merah. Hal ini menunjukkan bahwa kasein mengandung asam amino dengan gugus monofenol (asam amino tirosin). Pada tes Biuret, hasil yang diberikan juga positif dengan adanya warna ungu. Hal ini menunjukkan bahwa kasein adalah suatu protein. Dengan tes Xanthoprotein, hasilnya positif yang ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. Dengan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa kasein merupakan protein yang memiliki asam amino yang mengandung gugus aromatik atau inti benzen (misalnya asam amino fenilalanin, tiptofan dan tirosin). Pada tes Hopkins-Cole, hasil yang diperoleh juga positif dengan terentuknya cincin ungu. Hal ini menunjukkan bahwa kasein mengandung asam amino triptofan.

VI. Kesimpulan
Dari percobaan ini dapat diketahui bahwa asam amino dan protein dapat diidentifikasi dengan cara :
a. Test Millon untuk protein yang mengandung tirosin
b. Test Hopkins-Cole untuk protein yang mengandung triptofan
c. Test Biuret yang merupakan tes umum untuk protein
d. Test Ninhidrin untuk protein yang memiliki gugus asam alpha-amino
e. Test Xanthoprotein untuk asam amino yang mempunyai inti benzene
Perbedaan susu mentah dan susu yang telah dipasteurisasi dapat ditunjukkan dengan pemanasan, karena dengan pemanasan dapat merusak enzim yang terdapat pada susu. Test untuk membedakannya adalah :
a. Test Guaiac untuk enzim katalase
b. Test Schardinger untuk enzim dehidrogenase
Koagulasi dapat terjadi karena susu mengalami denaturasi. Faktor-faktor yang dapt menyebabkan denaturasi adalah :
a. Pengaruh logam berat
b. Dengan pemanasan
c. Dengan penambahan asam

DAFTAR PUSTAKA

Murray RF; Granner OK; Rodwell V. Harper’s Review of Biochemistry. Penerbit : Buku Kedokteran. Jakarta. 1995.
Dra. Azizahwati, Msi. Buku Penuntun Praktikum Biokimia. Laboratorium Biokimia Jurusan Farmasi FMIPA-UI. 1999 : 1-6.
Drs. Slamet Prawirohartono; Prof. Dr. Suhargono Hadisumarto. Sains Biologi-3A. Penerbit Bumi Aksara. 1999 : 65-66.
Anonim. Penuntun Praktikum Kimia Dasar Umum. Universitas Indonesia FMIPA Jurusan Kimia. 1998 : 115-118.

Reaksi konjugasi dan detoksifikasi

Mekanisme detoksifikasi dalam tubuh terdiri dari dua tahap utama yaitu :

Transformasi tahap I, terjadi proses oksidasi yang hasilnya dilanjutkan
Transformasi tahap II, yaitu proses konjugasi

Fungsi utama dari reaksi tahap satu dan dua adalah mengoksidasi senyawa xenobiotik dan melanjutkan dengan reaksi konjugasi untuk membuat senyawa xenobiotik menjadi bersifat polar dan mudah disekresikan melalui urin. Masalah yang dapat timbul adalah dihasilkannya produk oksidasi yang reaktif dan mempunyai afinitas yang tinggi pada DNA dan protein sehingga menyebabkan kerusakan DNA atau protein sel. Konjugasi pada DNA dan protein sel merupakan awal dari proses keracunan kronis yang diketahui dapat termanifestasi dalam bentuk berbagai penyakit degeneratif.

Tranformasi tahap II ini memberikan beberapa jalur konjugasi yang memperantarai racun yang bersifat minyak mudah larut dalam air, sehingga dapat dibuang melalui urin, empedu, tinja dan keringat. Reaksi konjugasi ini termasuk :

Konjugasi Glukuronidasi (Glucuronidation Conjugation)
Konjugasi Sulfasi (Sulfation Conjugation)
Konjugasi Glutation (N-acetyl cysteine, dimana asam amino cysteine dan methionin adalah bahan awal)
Konjugasi Acetylasi
Konjugasi Metilasi (Methylation Conjugation)
Konjugasi Asam Amino (Konjugasi glycine, taurine, glutamine, ornithin dan arginin)

Selama proses detoksifikasi, apabila proses tranformasi tahap I terlalu cepat, tetapi tahap dua terlambat, maka akan kelebihan bahan perantara yang sangat beracun, menyebabkan kerusakan jaringan yang lebih luas, sehingga memerlukan perlindungan antioksidan vitamin A-beta carotene, vitamin C, vitamin E, flavonoid, proantocyanin yang berasal dari tumbuh-tumbuhan.

Konjugasi Glukuronidasi (Glucuronidation Conjugation)
Konjugasi dengan asam glukuronat ini adalah bentuk transformasi tahap II yang paling umum. Gugusan glukuronat dapat dipindahkan ke beberapa group fungsional termasuk :
Alkohol, asam karbosilat, amine, thiols dan beberapa methylene group yang aktif.
Proses ini memerlukan enzim UDP-glukuronosyltransferase dan cosubstrat Uridine-5”-diphospho-alpha-glukuronic acid (UDPGA) sebagai sumber asam glukuronat.

Konjugasi Sulfasi (Sulfation Conjugation)
Merupakan transformasi tahap II yang menambah gugusan sulfat ke alcohol dan amine, menjadi bentuk sulfate atau sulfonamide, dibantu oleh enzim Sulfotransferase dan cosubstrat 3”-phosphoadenosine-5”-phosphosulphate (PAPS) sebagai sumber group sulfate.

Konjugasi Glutation
N-acetyl cysteine, dimana asam amino cysteine dan methionin adalah bahan awal.
Sangat penting dalam konjugasi tahap II pada hewan dan tumbuh-tumbuhan.
Dibawah pengaruh enzim glutathione S-transferase, glutation dapat bereaksi dengan serangkaian substrat termasuk epoxide, aryl dan alkyl halide dan bahan majemuk elektrofilik lainnya .
Glutation S-transferase terdapat pada fraksi sitosol kebanyakan sel dan organ tubuh seperti hati, ginjal, paru, dan usus halus (Commandeur et al., 1995).Glutation (GSH) adalah tripeptida (-L-glutamil-L-sisteinil-glisin) yang memainkan peran utama dalam biotransformasi dan ekskresi xenobiotika dan pertahanan sel terhadap oxidative stress (Josephy, 1997).
Glutation S-transferase (GST) merupakan keluarga enzim yang mengkatalisis reaksi konjugasi glutation dengan sejumlah besar xenobiotika elektrofilik endogen maupun eksogen. GST melindungi sel tubuh terhadap serangan senyawa elektrofil yang sering bersifat sitostatik, mutagenik, dan karsinogenik, dengan jalan mengkatalisis reaksi konjugasi antara gugus tiol (-SH) pada glutation (GSH) dengan pusat elektrofilik senyawa elektrofil. Reaksi ini akan menghasilkan produk konjugat glutation yang selanjutnya akan ditranspor ke ginjal dan dimetabolisme lebih lanjut menjadi asam merkapturat (Josephy, 1997).

Konjugasi Acetylasi
Tranformasi ini tidak menghasilkan racun-racun yang larut air. Alcohol dan amine dapat diacetylasi dengan acetyl CoA, dibawah pengaruh enzim acetyl transferase.

Konjugasi Metilasi (Methylation Conjugation)
Transformasi ini kurang penting dibanding transformasi tahap II lainnya.
Pada umumnya hanya dipakai untuk mentranformasi beberapa jenis thiols, phenol dan amines yang dihasilkan dalam tubuh saja dengan perantara S-Adenosyl methionine (SAM) dan dikatalisasi oleh beberapa jenis enzim methyl transferase.
Contoh :
Metabolisme epineprin oleh SAM dan catechol O-methyl transferase (COMT) .

Konjugasi Asam Amino
Konjugasi glycine, taurine, glutamine, ornithin dan arginin.
Konjugasi asam amino adalah konjugasi glycine dengan asam salisilat menjadi asam salicyluric .

CYP1A1

Terlibat dalam metabolisme senyawa hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH, polocyclic aromatic hydrocarbon). Enzim ini sangat penting dalam metabolisme hidrokarbon aromatik polisiklik dan dalam proses kasinogenesis yang ditimbulkan oleh senyawa ini. Sebagai contoh, jenis sitokrom ini didalam paru mungkin terlibat dalam proses konversi senyawa PAH inaktif (prokarsinogen) yang dihirup pada waktu

merokok menjadi senyawa karsinogen aktif lewat reaksi hidroksilasi. Para perokok mempunyai enzim ini dengan kadar lebih tinggi didalam sebagian sel dan jaringan tubuhnya bila dibandingkan dengan orang yang bukan perokok. Beberapa laporan menyebutkan bahwa aktivitas enzim ini dapat di tingkatkan (diinduksi) dalam plasenta ibu yang merokok; dengan demikian, kebiasaan merokok pada ibu hamil merupakan kondisi yang potensial untuk mengubah jml metabolit PAH (yg sebagian diantaranya merupakan unsur berbahaya) yg mengenai janin di dlm kandungan ibu tsb

Substrat
Teofilin, kafein, parasetamol, antipirin, warfarin,takrin, klozapin, haloperidol, flukosamin

Penghambat
Flukosamin, siprofloksasin, ofloksasin, simetidin, ketokonazl, eritromisin, klaritomisin

Penginduksi
Asap rokok, daging panggang, kembang kol, brokoli, rifampisin, olmeprazol, fenobarbital, fenitoin

Interaksi dlm metabolisme obat berupa induksi atau inhibisi enzim metabolisme, terutama enzim CYP! Induksi berarti peningkatan sintesis enzim metabolisme pada tingkat transkripsi sehingga terjadi peningkatan dosis obat tersebut, berarti terjadi toleransi farmakokinetik.

CYP2C19

CYP2C19
Sitokrom P450, famili 2, subfamili C, Polipeptida 19
Merupakan enzim monooksigenase
Terdapat di retikulum endoplasma hati
Fungsi ;
1.) bertanggung jawab untuk metabolisme agen
terapeutik (omeprazole, diazepam, barbiturat)
2.) sintesis kolesterol, steroid dan lipid
CYP2C19 dipengaruhi gen
3%-5% ras kaukasoid dan 12%-13% orang asia mengalami metabolisme rendah dengan enzim CYP2C19.

Con’d
Pada beberapa obat CYP2C19 menjadi jalur metabolisme primer, tapi lebih sering menjadi jalur metabolisme sekunder. Contoh;
Jalur primer omeprazol adalah CYP2C19 sedangkan jalur sekundernya adalah CYP3A4.
Bila aktivitas CYP2C19 normal tapi CYP3A4 mengalami inhibisi→metabolisme omeprazol tidak terganggu secara signifikan
Bila konsentrasi enzim CYP2C19 menurun, dan CYP3A4 mengalami inhibisi → konsentrasi omeprazol dalam tubuh meningkat karena metabolismenya terganggu

Substrat CYP2C19
Aripiprazole, Carisoprodol, Citalopram*, Clomipramine, Clopidogrel, Clozapine ,Desipramine, Diazepam*, Diphenyhidramine, Doxepin, Escilatopram*, Fluoxetine, Imipramine, Lansoprazole, Mephenytoin, Methadone, Moclobemide*, Nelvinafir, Olanzapine, Omeprazole*,Pantoprazole*, Pentamidine*, Phenobarbital, Phenytoin, Proguanil*, Propranolol, Raberprazole, Sertraline*, Thalidomide*,Voriconazole, R warfarin
(*) CYP2C19 menjadi jalur metabolisme primer
Tentang Diazepam
Diazepam (t1/2=20-100 jam ) termasuk obat dengan kelas terapi antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif.
Enzim utama yang digunakan dalam metabolisme diazepam adalah CYP2C19, CYP3A4 dan CYP3A5.
Metabolisme utama diazepam berada di hepar, menghasilkan tiga metabolit aktif ; nordiazepam, oxazepam, dan Temazepam.
Con’d
Jalur metabolisme diazepam :
diazepam CYP2C19 nordiazepam (t1/2=30-200 jam )
nordiazepam CYP3A4 oxazepam (t1/2=5-15 jam )
Temazepam (t1/2= 10-20 jam ) dimetabolisme CYP3A4 dan CYP3A5 lalu dikonjugasi dengan asam glukuronat sebelum dieliminasi dari tubuh.
Diazepam secara cepat terdistribusi dalam tubuh karena bersifat lipid-soluble, volume distribusinya 1,1L/kg, dengan tingkat pengikatan pada albumin dalam plasma sebesar (98-99%).
Diazepam diekskresikan melalui air susu dan dapat menembus barier plasenta

Con’d
Aplikasi penggunaan diazepam
Penggunaan diazepam untuk ibu hamil dan menyusui sebaiknya dihindari karena
1.)berpotensi menginhibisi neuron > pertumbuhan embrio lambat
2.) meningkatkan pH sel >pertumbuhan janin terganggu
3.) Pada trimester pertama masa kehamilan merupakan periode kritis maka bahan teratogen yang bersifat toksik akan mempengaruhi pertumbuhan embrio, bahkan dapat mengakibatkan kematian janin
Penggunaannya tidak lebih dari 3 bulan karena diazepam memilki waktu paruh yang panjang.

Inhibitor CYP2C19
Chloramphenicol, Cimetidine, Clopidogrel, Delavirdine, Efavirenz, Esopmeprazole, Felbamate, Fluconazole, Fluoxetine, Fluvoxamine, Isoniazid, Moclobemide, Modafinil, Omeprazole,Oxcarbazepin, Ticlopidine, Voriconazole
Inducer CYP2C19
Aminoglutethimide, Artemisinin, Barbiturat, Carbamazepin, Phenytoin, Pirimidone, Rifampin, Rifampetin

Inhibisi CYP2C19 tidak sepenuhnya menimbulkan konsekwensi buruk karena :
Substrat toksiknya tidak banyak
Enzim lain sering mengambil alih
peran CYP2C19

CYP2E1

CYP2E1
Cytochrom P 450 2E1 adalah salah satu anggota famili dari Sitochrom P 450.

Cytochrom P 450 merupakan protein yang bersifat monooksigenesis yang mengkatalis beberapa reaksi yang diperlukan dalam metabolisme obat-obatan dan sintesis kolesterol, steroid, dan lipid yang lain di retikulum endolasma.

Enzim CYP2E1 memetabolisme dalam tubuh diinduksi oleh etanol, aseton dan larutan lain juga substrat dari karbon tetraklorida, etilen, glikol dan nitrosamin yang ditemukan dalam rokok sebagai premutagen yang dapat meningkatkan karsinogenitass

Dalam beberapa substrat, enzim ini mungkin juga diperlukan dalam proses yang berbeda-beda seperti proses gluconeogenesis,sirosis hati, diabetes dan kanker
.
Fungsi
Metabolisme beberapa precarcinogen, obat-obatan dan larutan untuk reaksi metabolisme
Menonaktifkan sejumlah obat dan xenobiotik, juga bioactivate substrat xenobiotic untuk pembentukan hepatotoxic atau karsinogenik

Ligand
Substrat
Anastetik: halothane, isoflurane, enflurane
Paracetamol (analgesic, antipyretic)
Dapsone(antibiotik)
Theophylline (stimulan)
Ethanol (psychoaktive)
Chlorzoxazone ( muscle relaxant)
Toluene (pelarut)- primarily

Inhibitor
diethyldithiocarbamate ( dalam kanker)
Citemidine (H2-receptor antagonist)
Disulfiram (dalam alkohol)
Inducers
Acetone (cairan pembersih)
Ethanol (psychoative)
Isoniazid (dalam tuberculosa)
Contoh kasus
P 450(CYP) dan glutathione S-transferase (GST) diperlukan dalam aktivasi dan etoksifikasi karsinogen.
Interaksi antara lingkungan terbuka dan polymorpisme sitokrom P4502E1 (CYP2E1) dan glutatione S-tranferase M1 (GSTM1) berhubungan dengan kanker payudara telah diperkirakan, namun interaksi keduanya belum difokuskan.
Efek interaksi CYP2E1 dengan GSTM1 memodifikasi resiko pengembangan kanker payudara lepas dari efek rokok dan konsumsi alkohol.
Individu dengan C2/C3 genotype CYP2E1 memiliki resiko(OR=0.24, 95% CI=0.08-0.74) jika dibandingkan dengan C1/C1 genotype
Tidak terlalu berbeda dengan GSTM1 genptype(OR=1.05, 95% CI=0.73-1.50) antara kanker payudara dan kontrolnya.
interaksi antara CYP2E1 dengan GSTM1 telah diperoleh untuk pengembangan kanker payudara di wanita Taiwan yang tidak memiliki kebiasaan merokok dan mengkonsumsi alkohol, meskipun hasilnya tidak signifikan tetapi hal ini menunujukkan bahwa karsinogen lingkungan juga dapat memicu kanker payudara.

CYP2C9

Cyp adalah singkatan dari sitokrom P450
2 adalah bilangan arab yang menyatakan famili
C adalah subfamili
9 adalah gen individual
Terdapat di dalam hati
Substrat : warfarin, fluvastatin, celecoxib, lornoxicam, diclofenac, ibuprofen, naproxen, piroxicam, meloxicam, phenytoin, fluvastatin, sulfonylurea, glibenclamide, glimepiride, glipizide, tolbutamide, angiotensin II receptor antagonists, irbesartan, losartan,
Inducer : fenobarbital, rifampisin
Inhibitor : fenitoin, amiodaron, tolbutamid, glipizid, diklofenak, ibuprofen, fluvoksamin, fluoksetin, simetidin, dan omeprazol, Benzbromarone, Sulfaphenazole, fluconazole, Valproic acid