kesehatan

Flu Burung


A. PENDAHULUAN

Dalam beberapa tahun terakhir ini perhatian dunia kesehatan terpusat kepada semakin merebaknya penularan avian influenza A (H5N1). Meningkatnya kasus infeksi H5N1 yang menyebabkan kematian pada manusia sangat dikhawatirkan dapat berkembang menjadi wabah pandemi yang berbahaya bagi umat manusia di muka bumi ini.

Sejak lebih dari satu abad yang lalu, beberapa subtipe dari virus influenza A telah menghantui manusia. Berbagai jenis mutasi subtipe virus influenza A telah menyerang manusia dan menyebabkan pandemi (Gambar 1), sehingga tidaklah mengherankan jika kewaspadaan global terhadap wabah pandemi flu burung mendapatkan perhatian yang serius.

Diawali pada tahun 1918, dunia dikejutkan oleh wabah pandemi yang disebabkan virus influenza, yang telah membunuh lebih dari 40.000 orang, dimana subtipe yang mewabah saat itu adalah virus H1N1 yang dikenal dengan “Spanish Flu”. Tahun 1957, dunia kembali dilanda wabah global yang disebabkan oleh kerabat dekat virus yang bermutasi menjadi H2N2 atau yang dikenal dengan “Asian Flu” yang merenggut hingga 100.000 jiwa. Pada tahun 1968, virus flu kembali menyebabkan wabah pandemi dengan merubah dirinya menjadi H3N2. Mutan virus yang dikenal dengan “Hongkong Flu” ini telah menyebabkan 700.000 orang meninggal dunia.

Pada tahun 1997, dunia kembali dikagetkan dengan merebaknya avian influenza H5N1 yang menyerang dan menewaskan 6 orang penduduk Hongkong dari 18 orang yang terinfeksi. (Horimoto T, Kawaoka Y. 2001).  Pada tahun 2003, sebanyak 83 orang terinfeksi subtipe virus lainnya yaitu H7N7 dan H9N2. Pada tahun 2004, subtipe H5N1 dan H7N2 telah menginfeksi puluhan penduduk Vietnam, Thailand dan Kanada. Virus H5N1 lebih patogen daripada subtipe lainnya sehingga disebut sebagai Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza (HPAI). Virus H5N1 telah menyebar secara luas di antara beberapa negara-negara asia sampai tahun 2005, diantaranya adalah Kamboja, Cina, Hong Kong, Indonesia, Jepang, Laos, Malaysia, Korea Selatan, Thailand, dan Vietnam. Di tahun 2005, strain virus yang berbeda menyebar ke utara dan barat, pertama terjadi di Rusia, Kazakhstan dan Mongolia pada bulan Juli dan di Romania, Turki, dan Kroasia pada bulan Oktober.

Sampai dengan akhir bulan Agustus 2006, telah dilaporkan sebanyak 241 kasus infeksi dan 141 diantaranya telah meninggal dunia.Dalam Tabel 1, terlihat bahwa telah terjadi kecenderungan yang meningkat baik angka kesakitan ataupun angka kematian manusia yang terkena infeksi virus H5N1.

Sejak tahun 2003 telah terjadi penyebaran yang semakin luas dari HPAI – H5N1 ke beberapa negara lain, dengan angka kematian yang cukup tinggi. (WHO, 2006)

Di Indonesia pada bulan Januari 2004 di laporkan adanya kasus kematian ayam ternak yang luar biasa (terutama di Bali, Botabek, Jawa Timur, Jawa Tengah, Kalimantan Barat dan Jawa Barat). Awalnya kematian tersebut disebabkan oleh karena virus new castle, namun konfirmasi terakhir oleh Departemen Pertanian disebabkan oleh virus flu burung (Avian influenza (AI)).

Jumlah unggas yang matiakibat wabah penyakit flu burung di 10 propinsi di Indonesia sangat besar yaitu3.842.275 ekor (4,77%) dan yang paling tinggi jumlah kematiannya adalah propinsi Jawa Barat (1.541.427 ekor). Pada bulan Juli 2005, penyakit flu burung telah merenggut tiga orang nyawa warga Tangerang Banten, Hal ini didasarkan pada hasil pemeriksaan laboratorium Badan Penelitian dan Pengembangan Depkes Jakarta dan laboratorium rujukan WHO di Hongkong.

Tabel 1. Beberapa kasus infeksi Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza (HPAI) yang dilaporkan ke WHO sampai dengan bulan Agustus 2006.

Negara 2003 2004 2005 2006 Total
kasus mati kasus mati kasus mati Kasus mati kasus mati
Azerbaijan 0 0 0 0 0 0 8 5 8 5
Cambodia 0 0 0 0 4 4 2 2 6 6
China 1 1 0 0 8 5 12 8 21 14
Djibouti 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
Egypt 0 0 0 0 0 0 14 6 14 6
Indonesia 0 0 0 0 17 11 43 35 60 46
Iraq 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2
Thailand 0 0 17 12 5 2 2 2 24 16
Turkey 0 0 0 0 0 0 12 4 12 4
Vietnam 3 3 29 20 61 19 0 0 93 42
Total 4 4 46 32 95 41 96 64 241 141

Berdasarkan hasil kajian secara genomik, dikenal beberapa subtipe dari avian influenza, namun demikian selama 6 tahun terakhir hanya subtipe H5, H7 dan H9 yang diketahui mampu menyebar dari unggas ke manusia.

Selama tahun 2003 – 2004 telah teridentifikasi dua jenis genotip baru dari HPAI yang telah menyebarkan wabah di Thailand, Kamboja, Vietnam, Laos, Korea, Jepang, Cina dan Malaysia. Virus HPAI – H5N1 yang diisolasi dari beberapa korban yang meninggal di Vietnam menunjukkan bahwa virus tersebut telah resisten terhadap amantadin dan rimantadin. (Horimoto & Kawaoka, 2005).

  1. B. VIRUS INFLUENZA

Flu, atau influenza, menyerang alat pernapasan atas dan sering kali datang mendadak (akut). Umumnya, penyakit virus hanya menyerang manusia satu kali saja. Sebab, dengan infeksi satu kali sudah timbul kekebalan tubuh yang cukup. Namun, influenza berbeda. Kekebalan memang terjadi dengan dibuatnya zat-zat penolak dalam tubuh setelah terjadi serangan. Namun, zat-zat penolak itu tidak dapat bertahan lama. Setelah terkena flu, penderita dapat terjerat lagi 6-8 bulan kemudian. Meski demikian, jika terjadi suatu wabah, tidak semua orang akan terserang. Hal ini disebabkan adanya perbedaan daya tahan tubuh yang dimiliki setiap orang.

Virus influenza merupakan virus RNA yang termasuk dalam famili Orthomyxoviridae. Asam nukleat virus ini beruntai tunggal, terdiri dari 8 segmen gen yang mengkode sekitar 11 jenis protein. Virus influenza mempunyai selubung yang terdiri dari kompleks protein dan karbohidrat. Dua perbedaan varietas dari spike glikoprotein adalah pada amplopnya Virus ini mempunyai tonjolan (spikes) yang digunakan untuk menempel pada reseptor yang spesifik pada sel hospesnya pada saat menginfeksi sel. Terdapat 2 jenis spikes yaitu yang mengandung hemaglutinin (HA) dan yang mengandung neuraminidase (NA), yang terletak di bagian terluar dari virion.

Adapun morfologi virus ini ketika dilihat dibawah mikroskop elektron adalah terlihat sirkuler, bentuk oval dengan diameter sekitar 80 – 120 nm dengan duri (spike) pada permukaannya Struktur virus influenza sangat bervariasi, tetapi partikel virion biasanya sferis, selain itu ada juga yang membentuk filamen. Virus rata-rata berdiameter 90-100 nm dan ada juga yang bervariasi dari 180-120 nm. Virion influenza adalah virus beramplop yang terdiri dari lipid bilayer.

Struktur virus influenza :

  • Virion dikelilingi oleh sampul luar yang merupakan lapisan lipid bilayer. Lapisan lipid ini dibentuk dari membran plasma yang terinfeksi selama proses budding.
  • Glikoprotein yang menempel pada sampul virus, terdiri dari hemaglutinin (80%) dan neuraminidase (20%).

-       Hemaglutinin (HA)

Protein trimernya berfungsi dalam penempelan virus ke sel yang diinfeksi. Keberagaman HA dapat menyebabkan terjadinya evolusi strain baru dan epidemi influenza yang berkelanjutan. Nama hemaglutinin berasal dari kemampuannya mengaglutinasi eritrosit di bawah kondisi tertentu. Diperkirakan dalam satu virion influenza terdapat 1000 hemaglutinin.

-       Neuraminidase (NA)

Memfasilitasi pelepasan produk virus baru dari sel yang diinfeksi. Neuraminidase berfungsi pada akhir siklus replikasi virus. NA memudahkan pelepasan partikel virus dari permukaan sel yang terinfeksi selama proses pertunasan dan menolong mencegah agregasi sendiri oleh virion. Selain itu, NA dapat membantu virus menembus lapisan mukus di saluran pernapasan untuk mencapai sel epitel target.

  • Matriks protein : lapisan sebelah dalam sampul.
  • Pada bagian dalam amplop yang mengelilingi virion influenza adalah matriks protein antigen. Selama amplop nya adalah genom influenza, hal ini akan terorganisasi pada 8 segmen single strand RNA (hanya pada virus influenza tipe A dan B. Pada tipe C hanya terdapat 7 segmen). RNA tersebut dikemas dengan nukleoprotein sehingga membentuk ribonukleoprotein, dengan tiga RNA polimerase untuk tiap segmen RNA.

.

Virus influenza mempunyai 4 antigen yang terdiri dari (i) protein nukleokapsid (NP), (ii) hemaglutinin (HA), (iii) neuraminidase (NA), dan (iv) protein matriks (MP). Berdasarkan jenis antigen NP dan MP, virus influenza digolongkan dalam virus influenza A, B, dan C. Virus influenza A sangat penting dalam bidang kesehatan karena sangat patogen baik bagi manusia maupun bagi binatang(namun burung liar adalah tempat tinggal alamiah mereka.) yang menyebabkan angka kesakitan dan kematian yang tinngi di seluruh dunia. Isolasi pertama kali pada tahun 1933.Paling ganas di antar tipe yang lain. Virus tipe ini dapat menyebabkan penyakit saluran pernapasan akut. Sangat epidemik dan pandemik bahkan pada interval yang tidak teratur karena secara periodik mengalami perubahan variasi antigen.

Virus tipe A ini dibagi dalam beberapa Sub-tipe berdasar dua (2) jenis protein pada permukaannya. Protein ini disebut sebagai Hemaglutinin (HA) dan Neuroaminidase (NA).Virus influenza A ini dapat menyebabkan pandemi karena mudah bermutasi, baik secara antigenic drift ataupun antigenic shift, sehingga membentuk varian – varian baru yang lebih patogen. (hemaglutinin dapat mengalami mutasi (antigenic drift) dan rekombinasi (antigenic shift), sedangkan neuraminidase hanya mengalami beberapa variasi).

Virus influenza tipe A terbagi atas beberapa subtipe berdasarkan variasi antigen pada glikoprotein permukaan, HA dan NA. Variasi dinyatakan dengan penamaan HxNx. Terdapat 15 jenis subtipe HA(H1-H15) dan 9 jenis subtipe NA(N1-N9). Virus influenza unggas (Avian Influenza Viruses, AIV) termasuk tipe A. Unggas yang sakit mengeluarkan virus Influenza A (H5N1) dengan jumlah besar dalam kotorannya. Virus Inluenza A (H5N1) merupakan penyebab wabah flu burung pada unggas. Virus ini dapat bertahan hidup di air sampai 4 hari pada suhu 22°C dan lebih dari 30 hari pada 0°C.

. Dari berbagai penelitian seroprevalensi secara epidemiologis menunjukkan bahwa beberapa subtipe virus influenza A telah menyebabkan wabah pandemi antara lain H7N7 (1977), H3N2 (1968), H2N2 (1957), H1N1 (1918), H3N8 (1900), dan H2N2 (1889). Hanya beberapa Virus Flu tipe A yang umumnya saat ini menyerang manusia, yaitu H1N1, H1N2, dan H3N2 (strain dari H1N1 dan H3N2 yang saat ini bersiklus dan menyebabkan influenza musiman). Sedangkan beberapa sub-tipe umumnya terdapat pada hewan, misalnya H7N7 dan H3N8 yang menyebabkan penyakit flu pada kuda. Virus H7N7 dihubungkan dengan kematian tunggal dan dengan kasus conjungtivitas (iritasi mata) di negara Belanda. Sedang virus H7N2, H7N3 dan H9N2 menyebabkan sakit ringan pada manusia.

Virus influenza B adalah jenis virus yang hanya menyerang manusia, Kecepatan perubahan antigennya lebih rendah dari tipe A. Virus ini tidak diklasifikasi berdasar sub-tipe. Walaupun virus tipe B ini dapat menyebabkan epidemi (epideminya terbatas), tetapi tidak dapat menyebabkan pandemi. Virus influenza C, jarang ditemukan yang jarang dikenali (nonsimptomatik) walaupun dapat menyebabkan infeksi pada manusia dan binatang(babi dan anjing). Neuraminidase yang kurang diperkirakan menjadi penyebab rendahnya tingkat infektivitas virus ini. Virus tipe C berbeda secara struktural dengan virus tipe A dan B.. Jenis virus influenza B dan C jarang sekali atau tidak menyebabkan wabah pandemis. Cara pemberian nama yang sesuai nomenklatur konvensional untuk isolat virus influenza harus mengesankan tipe virus influenza tersebut, spesies penjamu (tidak perlu disebut kalau berasal dari manusia), lokasi geografis, nomor seri, dan tahun isolasi. Untuk virus influenza tipe A, subtipe-subtipenua dinamakan berdasar jenis protein HA dan NA, misalnya H1N2 adalah Virus Influenza tipe A yang mempunyai jenis protein HA 1dan protein NA2. Sehingga Virus Avian H5N1 adalah Virus Influenza Tipe A yang mempunyai protein HA 5 dan NA 1. Subtipe hemaglutinin dan neuramidasenya ditulis dalam kurung. Sebagai contoh, salah satu induk strain virus influenza unggas dalam wabah H5N1 berhasil diisolasikan dari seekor angsa dari provinsi Guangdong, China. Oleh karena itu ia diberi nama A/angsa/Guangdong/1/96 (H5N1). Sedangkan isolat yang berasal dari kasus infeksi H5N1 garis Asia pada manusia yang pertama kali terdokumentasikan terjadi di Hong Kong, dan dengan demikian disebut sebagai A/HK/156/97 (H5N1).

  1. C. PERKEMBANGBIAKAN VIRUS

Perkembangbiakan virus dibagi dalam beberapa tahap:

  1. Penempelan virion melalui HA ke reseptor spesifik yang terdapat pada membran sel hospes sehingga virion dapat menyusup masuk ke dalam sitoplasma membentuk endosom melalui proses endositosis.
  2. Setelah proses pelepasan pembungkus luar (uncoating), maka genom virus akan ditranslokasikan ke dalam nukleus melalui mekanisme transpor seluler.
  3. Di dalam nukleus, terjadi proses transkripsi oleh enzim polimerase virus (langkah 3a), dan proses replikasi RNA virus (langkah 3b).
  4. mRNA yang telah terbentuk akan bermigrasi ke dalam sitoplasma, akan ditranslasi menjadi protein pada poliribosom yang terdapat di dalam sitoplasma.
  5. Pascatranslasi, HA, NA dan M2 akan ditransportasi melalui badan golgi ke dalam membran sel (langkah 5b). Sedangkan NP, M1, NS1 dan NEP akan masuk ke dalam nukleus dan bergabung dengan genom RNA virus membentuk nukleokapsid (langkah 5a).
  1. Nukleokapsid akan bermigrasi ke dalam sitoplasma dan akan bergabung dengan beberapa protein struktural HA, NA dan M2, sehingga terbentuk partikel virion.
  2. Pelepasan partikel virion melalui proses pertunasan sehingga terbentuk virion baru.

Keterangan:

HA = hemaglutinin

NA = neuraminidase

M1 = protein selubung mayor

M2 = protein selubung minor

NP = nukleoprotein

NS1 = non – structural protein (protein non struktural 1)

NEP = nuclear export protein (protein nuklear asing)

Mutasi virus

  1. D. PENULARAN

Secara umum, penularan dari virus influenza dapat terjadi melalui inhalasi, kontak langsung ataupun kontak tidak langsung. Sebagian besar kasus infeksi HPAI pada manusia disebabkan penularan virus dari unggas ke manusia.

Tidak ada risiko yang ditimbulkan dalam mengkonsumsi daging unggas yang telah dimasak dengan baik dan matang. Bukti bahwa terjadinya transmisi dari manusia ke manusia jarang sangat jarang ditemukan, namun ada. Kekhawatiran yang muncul di kalangan para ahli genetika adalah bila terjadi rekombinasi genetik (genetic reassortment) antara virus infuenza burung dan virus influenza manusia, sehingga dapat menular antara manusia ke manusia.

Ada 2 kemungkinan yang dapat menghasilkan subtipe baru dari H5N1 yang dapat menular dari manusia ke manusia adalah (i). Virus dapat menginfeksi manusia dan mengalami mutasi sehingga virus tersebut dapat beradaptasi untuk mengenali ikatan RNA pada manusia atau virus burung tersebut mendapatkan gen dari virus influenza manusia sehingga dapat bereplikasi secara efektif di dalam manusia. Subtipe baru virus H5N1 ini bermutasi sedemikian rupa untuk membuat protein tertentu yang dapat mengenali reseptor yang ada pada manusia, sebagai jalan masuk ke dalam sel manusia , atau (ii). Kedua jenis virus, baik virus avian maupun human influenza dapat secara bersamaan menginfeksi manusia, terjadi rekombinasi genetik sehingga menghasilkan strain virus baru yang sangat virulen bagi manusia.

Walaupun perkiraan fase di mana penularan antar manusia ini masih belum dapat diketahui, akan tetapi pencegahan transmisi antar manusia ini perlu mendapatkan perhatian yang serius mengingat bahwa telah dilaporkan seorang perawat di Vietnam telah menderita penyakit serius setelah dia menangani pasien yang terinfeksi dengan virus H5N1. Dalam salah satu penelitian ditemukan bahwa mutasi dari H5N1 kemungkinan besar dapat menghasilkan varian virus H5N1 yang baru yang dapat mengenali reseptor spesifik yang ada dalam sel manusia (natural human 2 – 6 glycan), sehingga bila ini terjadi maka penularan virus H5N1 dari manusia ke manusia dapat terjadi dengan mudah.

  1. E. PATOGENESIS

Mutasi genetik virus avian influenza seringkali terjadi sesuai dengan kondisi dan lingkungan replikasinya. Mutasi gen ini tidak saja untuk mempertahankan diri, tetapi juga dapat meningkatkan sifat patogenesitasnya. Virus Influenza B dan beberapa Sub-tipe Virus A dibagi lagi kedalam Strain. Ada berbagai Strain pada Virus Tipe B dan Sub-tipe A. Strain baru Virus Flu akan menggantikan strain yang lama. Perubahan Strain ini terjadi secara “shift” atau “drift”. Ketika strain Virus baru ini muncul, maka sel pertahanan tubuh (antibodi) yang terbentuk karena infeksi virus Flu strain yang lama, tidak dapat memberikan perlindungan lagi kepada infeksi strain baru. Jadi Vaksin Flu harus diperbarui setiap tahun untuk mengikuti perubahan strain dari Virus Flu. Akibatnya, orang yang ingin melakukan vaksinasi Flu harus mengulang vaksinasinya secara teratur setiap tahun, karena proses perubahan strain virus flu tadi.

Manusia dapat terinfeksi virus Influenza tipe A,B atau C. Tetapi jenis Virus Flu A yang umumnya menyerang manusia adalah virus Flu subtipe H1N1, H1N2 dan H3N2. Antara tahun 1957 dan 1968 Virus Flu H2N2 juga terdeteksi menyerang manusia, namun sekarang tidak.

Hanya Virus Flu A yang menyerang Unggas. Burung liar secara alamiah adalah tempat tinggal beberapa subtipe Virus Flu A. Umumnya burungliar ini tidak sakit walaupun mereka terinfeksi Virus. Tetapi, unggas yang dipelihara seperti Ayam Ras atau Kalkun, dapat sakit parah dan mati karena serangan virus Flu Burung. Beberapa Strain Virus A juga menyebabkan unggas liar sakit parah dan mati.

Virus subtipe H5 dan H7 adalah Virus Flu Burung. Virus Avian Flu dapat diklasifikasi kedalam Virus yang Fatalitas Tinggi (HPAI) dan Virus yang Fatalitas Rendah (LPAI). Pembagian ini berdasar bentuk genetik Virus. Umumnya HPAI dikaitkan dengan tingkat kematian tinggi pada peternakan unggas. Apakah Fatalitas yang Tinggi atau Rendah pada unggas ini berhubungan dengan risiko penularan pada manusia belum diketahui secara pasti.Virus HPAI dapat membunuh 90 – 100% unggas yang terinfeksi, tetapi LPAI menyebabkan sakit ringan atau tanpa gejala pada ayam.Tetapi virus LPAI dapat berubah menjadi HPAI, sehingga wabah Virus H5 atau H7 LPAI seharusnya tetap dimonitor oleh Dinas Peternakan.

Penelitian terhadap virus H5N1 yang diisolasi dari pasien yang terinfeksi pada tahun 1997, menunjukkan bahwa mutasi genetik pada posisi 627 dari PB2 yang mengkode ekspresi polymerase basic protein (Glu627Lys) telah menghasilkan highly cleavable hemagglutinin glycoprotein yang merupakan faktor virulensi, yang dapat meningkatkan aktivitas replikasi virus H5N1 dalam sel hospesnya. Disamping itu adanya substitusi pada nonstructural protein (Asp92Glu), menyebabkan H5N1 resisten terhadap interferon dan tumor necrosis factor α (TNF – α) secara in vitro.

Infeksi virus H5N1 dimulai ketika virus memasuki sel hospes setelah terjadi penempelan spikes virion dengan reseptor spesifik yang ada pada permukaan sel hospes. Virion akan menyusup ke sitoplasma sel, mengintegrasikan materi genetiknya di dalam inti sel hospesnya, dan menggunakan materi genetik dari sel hospesnya, virus bereplikasi membentuk virion – virion baru, dan virion – virion ini dapat menginfeksi kembali sel – sel disekitarnya. Dari beberapa hasil pemeriksaan terhadap spesimen klinik yang diambil dari penderita, ternyata avian influenza H5N1 dapat bereplikasi di dalam sel nasofaring, dan di dalam sel gastrointestinal, di dalam darah, cairan serebrospinal dan tinja pasien.

Fase penempelan (attachment) adalah fase yang paling menentukan apakah virus bisa masuk atau tidak ke dalam sel hospesnya untuk melanjutkan replikasinya. Virus influenza A melalui spikes hemaglutinin (HA) akan berikatan dengan reseptor yang mengandung asam sialat (sialic acid / SA) yang ada pada permukaan sel hospesnya. Terdapat perbedaan penting antara molekul reseptor yang ada pada manusia dibandingkan dengan reseptor yang ada pada unggas atau binatang. Pada virus flu burung, mereka dapat mengenali dan terikat pada reseptor yang hanya terdapat pada jenis unggas, yang terdiri dari oligosakarida, yang mengandung asam N – asetilneuraminat – 2,3 – galaktosa (SA – 2,3 – Gal), di mana molekul ini berbeda dengan reseptor yang ada pada manusia. Reseptor yang ada pada permukaan sel manusia adalah SA – 2,6 – galaktosa (SA – 2,6 – Gal). Sehingga secara teoritis virus flu burung tidak bisa menginfeksi manusia karena perbedaan reseptor spesifiknya. Namun demikian, dengan perubahan hanya 1 asam amino saja pada konfigurasi reseptor tersebut dapat diubah sehingga reseptor pada manusia dapat dikenali oleh HPAI – H5N1. Potensi virus H5N1 untuk melakukan mutasi inilah yang dikhawatirkan sehingga virus dapat membuat varian – varian baru dari HPAI – H5N1 yang dapat menular dari manusia ke manusia.

Salah satu perubahan virus adalah “Drift Antigenik”, dimana Virus berubah sedikit demi sedikit secara terus menerus dalam waktu yang lama. Proses Drift Anrigenik menghasilkan virus strain baru yang tidak dapat dikenali oleh antibodi virus yang lama. Sehingga setiap tahun terjadi perubahan strain virus influenza. Ini sebabnya orang dapat terserang Flu beberapa kali, karena virus Flu berubah strainnya secara terus menerus. Sehingga, orang yang ingin divaksinasi Flu harus melakukannya secara teratur setiap tahun.

Cara perubahan lain ialah dengan cara “Shift Antigenik”, yaitu perubahan yang mendadak pada Virus Flu A, dan menghasilkan Virus Flu A yang baru yang dapat menginfeksi manusia. Virus ini juga mempunyai hemmaglutinin dan Neuroamidase yang tidak teridentifikasi oleh manusia. Dan kalau Virus Flu strain baru ini masuk menginfeksi manusia, dan manusia tidak mempunyai kekebalan atau perlindungan dari strain yang baru, dan virus dapat menyebar dari satu manusia ke manusia lain, terjadilah Wabah Besar yang disebut Pandemi.

Ahli kesehatan mengatakan bahwa babi dapat membawa virus influenza, yang dapat menggabungkan (homolog pertukaran genom yaitu sub-unit oleh reassortment genetik.) Dengan virus  avian, menukar gen dan kemungkinan bermutasi menjadi bentuk yang dapat lewat dengan mudah  menular di antara manusia.

Penelitian terbaru Taubenberger et al (Taubenberger JK, Reid AH, Lourens RM, Wang R, Jin G, Fanning TG. Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes. Karakterisasi virus influenza tahun 1918 polimerase gen. 2005 Oktober 6; 437 (7060) :889-893) menunjukkan bahwa tahun 1918 seperti virus H5N1 adalah virus flu burung. Selain itu, Tumpey dan kolega (Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, Zeng H, Solorzano A, Swayne DE, Cox NJ, Katz JM, Taubenberger JK, Palese P, Garcia-Sastre A. Penggolongan yang direkonstruksi 1.918 virus pandemi influenza Spanyol . Science. 2005 Oktober 7; 310 (5745) :77-80) yang merekonstruksi H1N1 virus tahun 1918 sampai pada kesimpulan bahwa adalah terutama polimerase gen dan gen HA dan NA ekstrem yang menyebabkan virulensi dari virus ini. Rangkaian dari polimerase protein (PA, PB1, dan PB2) dari tahun 1918 dan selanjutnya virus virus manusia berbeda hanya 10 asam amino dari virus flu burung. Tidaklah mungkin bahwa mutasi lain juga akhirnya akan muncul dan membuat virus H5N1 lebih cocok untuk manusia ke manusia. Faktor penting lain adalah perubahan dari protein HA preferensi yang mengikat 2,6 alfa asam sialic (bentuk utama dalam saluran pernafasan manusia). Dalam virus flu HA preferentially mengikat protein 2,3 alfa asam sialic, yang merupakan bentuk utama dalam saluran usus unggas. Telah menunjukkan bahwa hanya satu perubahan asam amino dapat mengakibatkan perubahan preferensi mengikat ini. Secara keseluruhan tampak bahwa hanya beberapa mutasi yang diperlukan untuk membuat virus flu burung H5N1 virus pandemi seperti pada tahun 1918.

  1. F. GEJALA KLINIK

Masa inkubasi virus avian influenza A (H5N1) sekitar 2 – 4 hari seteah terinfeksi, namun berdasarkan hasil laporan belakangan ini masa inkubasinya bisa mencapai antara 4 – 8 hari.

Sebagian besar pasien memperlihatkan gejala awal berupa demam tinggi (biasanya lebih dari 380C) dan gejala flu serta kelainan saluran nafas. Gejala lain yang dapat timbul adalah diare, muntah, sakit perut, sesak dada, hipotensi, dan juga dapat terjadi perdarahan pada hidung dan gusi. Gejala sesak nafas mulai terjadi setelah 1 minggu berikutnya.

Gejala klinik juga dapat memburuk dengan cepat yang biasanya ditandai dengan pneumonia berat, dyspnea, tachypnea, gambaran radiografi yang abnormal dan kelainan segmental atau lobular. Kematian dan komplikasi biasanya disebabkan oleh kegagalan pernafasan, sindrom pernafasan akut atau acute respiratory distress syndrome (ARDS), pneumonia, hemorrhagic pulmonari, pneumotoraks, pancytopenia, sindrom Reye’s, sindrom sepsis dan bakteremia. Gambaran lain yang juga sering dijumpai berdasarkan hasil laboratorium adalah leukopenia, limfopenia, trombositopenia, peningkatan aminotransferase, hiperglikemia dan peningkatan kreatinin.

  1. G. DIAGNOSIS LABORATORIUM

Penderita yang terinfeksi H5N1 pada umumnya dilakukan pemeriksaan spesimen klinik berupa usapan tenggorokan dan cairan nasal. Untuk uji konfirmasi terhadap infeksi virus H5N1, harus dilakukan pemeriksaan dengan cara (a). Mengisolasi virus, (b). Deteksi genom H5N1 dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan sepasang primer spesifik, (c). Tes imunoflouresensi terhadap antigen dengan menggunakan monoklonal antibodi terhadap H5, (d). Pemeriksaan adanya peningkatan titer antibodi terhadap H5N1, dan (e). Pemeriksaan dengan metode western blotting terhadap H5 – spesifik. Untuk diagnosis pasti, salah satu atau beberapa dari uji konfirmasi tersebut diatas harus dinyatakan positif.

  1. H. PENGOBATAN DAN PENCEGAHAN

Dewasa ini terdapat 4 jenis obat antiviral untuk pengobatan ataupun pencegahan terhadap influenza, yaitu amantadin, rimantadin, zanamivir dan oseltamivir (tamiflu). Mekanisme kerja amantadin dan rimantadin adalah menghambat replikasi virus. Namun demikian kedua obat ini sudah tidak mempan lagi untuk membunuh virus H5N1 yang saat ini beredar luas. Sedangkan zanamivir dan oseltamivir merupakan inhibitor neuraminidase. Sebagaimana kita ketahui bahwa neuraminidase ini diperlukan oleh virus H5N1 untuk melepaskan diri dari sel hospes pada fase pertunasan sehingga membentuk virion yang infektif. Bila neuraminidase ini dihambat oleh oseltamivir atau zanamivir, maka replikasi virus tersebut dapat dihentikan. Namun demikian belum ada uji klinik pada manusia yang secara resmi dilakukan untuk mengevaluasi efektivitas dari zanamivir dan oseltamivir untuk pengobatan avian influenza A (H5N1). Secara in vitro memang telah diketahui bahwa virus H5N1 sensitif terhadap oseltamivir dan zanamivir, sehingga pemberian oseltamivir atau zanamivir dianjurkan pada penderita yang diduga terinfeksi virus H5N1. Namun belakangan ini telah ditemukan bahwa virus H5N1 yang diisolasi dari beberapa kasus penderita flu burung telah resisten terhadap oseltamivir.

Beberapa obat lain sedang diteliti untuk dapat digunakan sebagai penghambat virus H5N1 antara lain adalah peramivir, neuraminidase inhibitor long – acting topical, ribavirin dan interferon alfa.

Disamping pemberian obat antiviral, terapi suportif di dalam perawatan di rumah sakit sangat penting untuk dilaksanakan. Sebagian besar penderita memerlukan oksigenasi, dan pemberian cairan parenteral (infus). Obat lain yang dapat diberikan adalah antibiotika berspektrum luas dan juga kortikosteroid.

Sampai saat ini belum ada vaksin yang tersedia untuk mencegah manusia terhadap infeksi H5N1. Berbagai upaya pengembangan vaksin H5N1 untuk manusia telah dan sedang dilakukan. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases USA (NIAID), menyatakan bahwa uji keamanan terhadap vaksin baru H5N1 telah dilakukan sejak awal tahun 2005. Beberapa perusahaan farmasi antara lain Sanofi Pasteur dan Chiron sedang mengembangkan kandidat vaksin yang akan melakukan uji klinik fase I bekerjasama dengan NIAID. Beberapa negara lain yang juga tengah mengembangkan vaksin H5N1 antara lain adalah Jepang, China, Hongaria, dll.

I. CARA PEMBUATAN VAKSIN FLU BURUNG

  1. 1. SECARA UMUM
Uji Kontrol Kualitas:

  • Uji HA
  • Uji kandungan virus (EID50)
  • Uji Patogenesis
  • Uji Salmonella
  • Uji Mycoplasma
  • Uji sterilitas
Uji Kontrol:

  • Tes inakivasi
  • Deteksi residu formalin
Uji Kontrol Kualitas:

  • Uji Sterilitas
  • Uji Stabilitas
  • Kontrol emulsi
  • Uji Imunogenitas
  • Uji Keamanan
  1. 2. SECARA KHUSUS

Pembuatan vaksin flu burung dengan teknik reverse genetic kini dibagi menjadi dua tahap. Pertama, kemampuan untuk melakukan modifikasi genetik terhadap virus Highly Pathogenetic Avian Influenza (HPAI), dengan menghilangkan bagian virus yang bersifat virulen, sehingga menjadikan virustidak berbahaya lagi. Kedua, kemampuan menghasilkan reassortant yang berasal dari virus HPAI yang telah dimodifikasi dengan vaksin manusia, seperti A/PR/8/34. Reassortant tersebut dapat berkembang dengan baik pada sel mamalia dan telur. Virus ini bertindak layaknya virus yang telah di atenuasi untuk vaksin manusia sehingga keamanan vaksin dapat ditingkatkan untuk persiapan menghadapi pandemi.

Supaya vaksin efektif, virus nonvirulen yang digunakan harus cocok dengan genetik strain virus yang meninfeksi manusia. Perangsangan terhadap sistem imun terjadi apabila terpapar dengan bentuk strain virus nonpatogen yang menyebabkan terbentuknya antibodi yang akan melindungi tubuh sehingga menjadi resisten terhadap virus patogen. Langkah pertama yang dilakukan adalah mengidentifikasi kemudian membuat kembali subtipe dari dua protein permukaan virus, yaitu hemaglutinin (HA) dan neuramidase (NA), Kedua protein ini adalah bagian aktif dari virus yang menentukan virulensi virus dan target dariintervensi virus.

Dengan menggunakan reverse genetics, para ilmuwan dapat memotong enal gen yang diinginkan dari virus yang tidak berbahaya, gen HA dan NA dari strain yang meninfeksi manusia (HA dan NA telah dibuat menjadi nonvirulen) dan memasukan ke dalam potongan sirkuler DNA plasmid. Plasmid kemudian ditransfer ke dalam sel hewan dan bibit vaksin virus ini dapat ditumbuhkan untuk memproduksi vaksin dalam jumlah besar. Selain itu bahan tambahan juga diberikan je dalam vaksin untuk meningkatkan respon imun yang dihasilkan oleh vaksin. Aluminium hidroksida dan MF 59 diberikan sebagai adjuvan untuk maksud diatas.

Sel inang yang digunakan untuk menumbuhkan plasmid yang telah disisipkan gen virus adalah sel ginjal dari monyet hijau Afrika yang dikenal sebagai sel Vero. Sel Vero ini tidak karsiogen dan tidak membawa penyakit menular sehingga aman untuk digunakan sebagai sel inang.

Terdapat beberapa kesulitan dalam pembuatan vaksin ini diantaranya kesulitan dalam mentransfeksisel denga plasmid dan membutuhkan virus yang cukup untuk digunakan sebagaoi bibit stok serta dibutuhkan sel delapan sampai dua belas plasmid pembawan berbagai elemen virus ke dalam sel Vero untuk proses transfeksi.
J.PENGUJIAN YANG DILAKUKAN TERHADAP VAKSIN AVIAN INFLUENZA

  1. 1. UJI KONTROL KUALITAS VAKSIN

1.1 Uji HA

Interpretasi hasil:

  • Hasil positif bila terbentuk lapisan tipis sel darah merah yang menunjukkan adanya hemaglutinin.
  • Hasil negatif bila terbentuk endapan tajam sel darah merah (sama seperti sumuran kontrol) yang menunjukkan tidak adanya hemaglutinin.

Titer HA didapatkan dari kebalikan pengenceran tertinggi dari suspensi virus. Agar dapat dijadikan vaksin, titer HA harus lebih dari 29.

1.2 Penentuan EID50

Prinsip

Virus AI dapat menyebabkan aglutinasi sel darah merah ayam. Larutan virus yang akan dititrasi diinokulasikan pada embrio telur ayam SPF. Kriteria infektivitas adalah hemaglutinasi yang disebabkan oleh cairan alantoik dari telur terinokulasi dan/atau kematian embrio. Titer ditunjukkan dalam satuan dosis infektif 50% telur.

Bahan-bahan

  • Suspensi virus
  • Dapar dalin fisiologis
  • Suspensi sel darah merah ayam 2%
  • Embrio telur ayam SFP usia 9 atau 10 hari

Skema Uji EID50

Titer infektif dihitung dengan menggunakan metode Spearman-Kärber:

Keterangan:

x       : pengenceran tertinggi yang menyebabkan semua telur tidak terinfeksi (dinyatakan sebagai kebalikannya atau nilai positifnya)

d       : faktor pengenceran (pengenceran 10 kali, faktor pengencerannya adalah 1)

Ór     : total jumlah telur yang tidak terinfeksi (pada jangkauan 0-100% terinfeksi)

n       : jumlah telur pada setiap pengenceran

Contoh soal:

Tabel 1. Hasil pengamatan telur pada uji hemaglutinasi

Pengenceran Hasil tes HA pada telur ke- Jumlah telur yang terinfeksi Jumlah telur yang tidak terinfeksi
1 2 3 4 4
10-1 + + + + 4
10-2 + + + + 4
10-3 + + + + 4
10-4 + + + + 4 0
10-5 + + + + 4 1
10-6 + + + - 3 2
10-7 + + - - 2 3
10-8 + - - - 1 4
10-9 - - - - 0
10-10 - - - - 0

x = 9

d = 1

Ór = 4+3+2+1+0

n = 4

Maka
= 7,0

Jadi kandungan virus = 107,0 EID50 / 0,2 mL

1.3. Uji Keamanan

10 ayam leghorn putih SPF (3 minggu) seronegatif virus H5N2

Masing-masing ayam disuntikan 2 kali dosis vaksin uji secara subkutan

Diamati selama 2 minggu setelah penyuntikan

Hasil dapat diterima àsetelah 2 minggu semua ayam hidup dan tidak lebih dari seekor ayam pun menunjukan gejala reaksi yang tidak  biasa

1.4. Uji Immunogenisitas

  • 60 ayam SPF umur 10 hari dibagi dalam 2 grup.
    • Grup I diinokulasi dengan 0,25 ml vaksin, sedangkan
    • Grup II sebagai control
    • Setelah 25 hari semua ayam ditantang dengan virus AIV-H5N2 via injeksi. Pemerian preparat histopat dilakukan pada hari ke 3,6,10, dan 20 hari setelah ditantang.
    • Hasil menunjukan bahwa kelompok control menampakan perubahan berupa encephalitis, kongesti, pendarahan, dan nekrosis pada paru-paru, otot jantung, pancreas, hati, dan ginjal.
    • Kelompok yang divaksinasi tidak menunjukan gejala klinis terkecuali sedikit perubahan pada organ dan jaringan. Jadi ada perbedaan yang nyata antara kedua grup tersebut diatas.

1.5. Uji Patogenitas Virus

16 ekor ayam SPF untuk 5 minggu dibagi dalam 2 grup:

  • Grup I diinokulasikan dengan 0,2 ml pengenceran 10-10/ekor.
  • Grup II (control) diinokulasikan cairan allantois normal telur SPF berembrio.

Hasil menunjukan bahwa ayam harus tetap hidup selama pengamatan 7 hari tanpa gejala klinis, kecuali suhu tubuh lebih tinggi sedikit dari normal.

1.6. Uji Mycoplasma

Inokulasi masing-masing 0,25 ml sampel pada 4 medium padat dalam cawan petri

Inokulasi 10 ml setiap sampel ke dalam 100 ml medium cair

Inkubasi 2 cawam petri secara aerob (35-37 oC,5-10% CO2 , kelembaban tinggi)

dan 2 cawan petri secara anaerob (atmosfer nitrogen, 5-10% CO2 , kelembaban tinggi) selama 28 hari

Hari ke-3 / 4 setelah inokulasi, subklultur 0,25 ml  dari media cair pada 2 media oadat dalam cawan petri

Inkubasi 1 cawan petri secara aerob dan 1 cawan petri secara anaerob (35-37 oC à inkubasi selama 28 hari)

Ulangi prosedur subkultur pada hari ke-6 , 7, atau 8, dan hari ke-13 atau 14

Amati media cair setiap 2-3 hari dan bila muncul perubahan warna, segera disubkultur

Interpretasi hasil:

  • Pada hari terakhir inkubasi (28 hari), uji semua sampel yang diinokulasi ke media padat secara mikroskopik terhadap adanya koloni mycoplasma.
  • Sampel lulus, bila pada control positif muncul pertumbuhan koloni mycoplasma dan bila pada sampel tidak muncul koloni.
  • Bila lebih dari satu cawan petri terkontaminasi dengan bakteri atau fungi, atau rusak, tes tidak valid dan harus diulang.
  • Bila koloni mycoplasma ditemukan pada cawan petri, tes harus diulang untuk mengkonfirmasi adanya kontaminasi mycoplasma. Dua kali volume (0,5 ml) dari sampel digunakan untuk tes ulang.
  • Bila koloni mycoplasma ditemukan pada cawan petri pada tes ulang, sampel tidak memenuhi syarat.

1.7. Uji Salmonella

5 sampel dari tiap bets sebanyak 5 ml atau 1 ½ dari isi wadah diinokulasi masing-masing ke dalam  100 ml trypose broth dan tetrathionate broth

Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35-37 oC

Dari setiap broth, dipindahkan ke media MacConkey dan Salmonella-Shigella agar

Inkubasi selama 18-24 jam, diuji

Interpretasi hasil:

  • Bila tidak ada pertumbuhan dari Salmonella, agar plat harus diinkubasi kembali selama 18 sampai 24 jam dan diuji kembali.
  • Bila terdapat pertumbuhan salmonella dilakukan kultur lebih lanjut pada media diferensial yang cocok untuk identifikasi positif. Bila terdapat salmonella, sampel tidak memenuhi syarat.

1.8. Tes Inaktivasi

Prisip:

Adanya virus (dari telur berembrio) yang diinokulasikan kedalam cairan alantoik akan menyebabkan pertumbuhan embrio yang abnormal, kematian atau produksi hemaglutinin dalam cairan alantoik. Tidak adanya efek tersebut menunjukan bahwa suspensi virus yang diuji telah inaktif.

Material:

  • Antigen virus yang diuji
  • Virus baku yang tidak diinaktivasi
  • Telur ayam SPF berembrio usia 9 sampai 11 hari
  • Suspensi sel darah merah ayam (hanya untuk uji virus yang menghemaglutinasi)

Prosedur:

  1. Inokulasi 10 telur dengan 0,2 ml sediaan uji per telur secara intraalantoik
  2. Inokulasi 5 telur dengan antigen (virus) baku, dengan perlakuan yang sama
  3. Inkubasi telur selama 5-7 hari pada suhu 380 C. amati telur dicahaya untuk mendeteksi embrio yang mati pada 24 jam pertama. Keluarkan embrio yangmengalami kematian yang dianggap sebagai kematian nonspesifik.
  4. Tes HA dilakukan terhadap cairan alantoik dalam telur yang mati dalam 24 jam pertama, dengan menggunakan sel darah merah ayam.
  5. Sesudah perbanyakan pertama, semua embrio diperiksa: tidak ada pertumbuhan abnormal atau kematian yang diakibatkan oleh suspensi virus. Panen cairan alantoik dari telur yang mati setelah 24 jam dan cairan alantoik telur hidup. Lakukan secara terpisah.
  6. Inokulasi 10telur dengan 0,2 ml cairan alantoik telur yang mati. Lanjutkan perlakuan yang sama dengan cairan alantoik telur hidup.
  7. Inkubasikan telur selama 5-7 hari pada 38oC.
  8. Periksa semua embrio setelah perbanyakan kedua: tidak ada pertumbuhan abnormal atau kematian yang disebabkan oleh suspense virus. Untuk virus yang menghemaglutinasi, uji untuk hemaglutinin dalam cairan alantoik dilakukan dengan menggunakan sel darah merah ayam.

Uji memuaskan apabila telur yang diinokulasi dengan sediaan uji:

  • Kurang dari 20% telur mati pada setiap tahap.
  • Tidak ada pertumbuhan embrio yang abnormal atau kematian yang disebabkan oleh suspense virus yang diuji setelah perbanyakan pertama dan kedua.
  • Untuk virus yang menghemaglutinasi, tidak ada hemaglutinasi yang teramati.

Gambar. Anatomi telur berembrio

1.9. Deteksi Residu Formalin

Formaldehid bebas tidak lebih dari 0,05%, jika ditetapkan dengan cara sebagai berikut:

Ambil 1 ml sediaan uji, tambahkan 4 ml air dan 5 ml asetilaseton LP. Hangatkan dalam penanas air pada suhu 40oC selama 40 menit. Warna yang terjadi tidak lebih kuat dari warna larutan pembanding yang dibuat dengan cara dan dalam waktu yang sama, yakni denganmenggunakan 1 ml larutan yang menggunakan formaldehid (CH2O 0,05%)  sebagai pengganti larutan uji.

Pada saat membandingkan, amati tabung dalam posisi vertical dari atas.

1.10. Uji Sterilitas

Cairan yang diperiksa dimasukan kedalam tabung reaksi dengan tutup kapas. Sampel kemudian dibagi 5:

  • Bagian pertama dimasukan kedalam plat agar darah, didiamkan selama 2 minggu pada suhu 36-37oC, pengamatannya adalah jika ada bakteri maka termasuk jenis gram positif atau gram negative.
  • Bagian kedua dimasukan kedalam medium semisolid dan didiamkan selama 2 minggu pada suhu 36-37oC, jika ada pertumbuhan mikroba pada medium ini diamati apakah mikroba termasuk jenis termasuk jenis aerob atau anaerob.
  • Bagian ketiga dimasukan kedalam medium brewer dan didiamkan selama 2 minggu pada suhu 36-37oC, jika ada pertumbuhan mikroba pada medium berarti mikroba ini termasuk jenis anaerob.
  • Bagian keempat dimasukkan kedalam medium sabouraud (padat) dan didiamkan selama 2 minggu pada suhu 15-22oC, jika ada pertumbuhan mikroba pada medium ini, maka mikroba ini termasuk jenis kapang.
  • Bagian kelima dimasukan kedalam medium Trypticase, jika ada pertumbuhan mikroba pada medium ini maka microba ini termasuk jenis kapang.

1.11. Uji Stabilitas

  • Lama pengujian: 18 bulan
  • Suhu pengujian : 27oC
  • Frekuensi sampling : 3 bulan
  • Syarat: minimal 80% ayam uji mempunyai titer HI ≥16
  • Prosedur :

Vaksin sampel

Disuntikkan kepada 10 ayam

4 minggu

Serum diambil dan diuji titer HI-nya

  • Kesimpulan uji stabilitas:

Dari data pengamatan diperoleh hasil bahwa potensi vaksin dapat dipertahankan sampai 15 bulan (minimal 80% ayam uji mempunyai titer HI ≥16). Oleh karena itu, waktu kadaluarsa vaksin yang dicantumkan pada kemasan adalah selama 12 bulan

2. UJI SEROLOGI

2.1. Uji Inhibisi Hemaglutinasi (HI)

Gambar. Titrasi untuk menentukan titer HI

Catat level antibody pada setiap serum, yang biasanya dinyatakan dalam log2 atau log indeksnya saja. Misalnya: titer 26 akan dicatat sebagai 6 saja.

  • Pada sumur yang terdapat antibody, akan terjadi inhibisi hemaglutinasi. Sel darah merah akan ada didalam sumur berbentuk bulatan.
  • Pada sumur yang tidak terdapat andibodi akan terjadi aglutinasi pada sel darah merahnya.
  • Titer HI dianggap positif bila terjadi inhibisi pada larutan serum 1/16 (24 bila diekspresikan sebagai timbal balik) atau lebih terhadap 4 HAU (hemaglutinating agent unit) dari antigen.

Gambar. Uji Inhibisi Hemaglutinasi

K. PENGUJIAN YANG DILAKUKANTERHADAP TABLET OSELTAMIVIR FOSFAT

1. Aplikasi Penerapan Penetapan Aktivitas Oseltamivir Fosfat

Dilakukan untuk menentukan keberadaan antibodi dalam serum pasien yang mendapat dosis regimen oseltamivir dengan mengukur penurunana aktivitas enzimatik NA, yang diperolah dengan menginkubasi masing-masing serum uji dengan sejumlah kuantitas NA yang baru saja dititrasi. Hasilnya penurunan OD yang berlawanan dengan jumlah antibodi dalam serum.

Prinsip: pengukuran galaktosa yang dilepaskan oleh fetuin  konsentrasi asam sialat  neuraminidase yang ada.

  1. 1. Penyiapan Larutan Standar

Alat:

- Plate ELISA

- Spektroskopi

Bahan:

- Larutan fetuin

- Larutan antigen standar: Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) 10 U/ml

- Larutan dapar karbinat-bikarbonat 0,1 M pH 9,6

- Larutan dapar PBS pH 7,4 yang mengandung 0,5% Tween 20

- Konjugat PNA-POD (peanut agglutinin-peroksidase)

- Substrat kromogenik TMB (Terta Metil Benzidine)

Bovine Albumin Serum (BSA)

Prosedur:

  1. Plate ELISA disensitisasi oleh antigen dengan penambahan 150 ml/well larutan fetuin konsentrasi akhir 50 µg/ml dalam larutan dapar karbonat-bikarbonat 0,1 M pH 9,6.
  2. Sebagian fetuin akan terabsorbsi sedang sebagian fetuin yang bebas dicuci hingga bersih dengan 350 µl dapar PBS pH 7,4 yang mengandung 0,5% Tween 20 sebangyak 6.
  3. Encerkan larutan standar: Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) 10 U/ml dengan dapar PBS dengan perbandingan 1:50, tambahkan Ca+ dan 1% Bovine Albumin Serum (BSA).
  4. Masukkan ke dalam well plate ELISA, well pertama akan mengandung 10 U/ml konsentrasi NA, well berikutnya mengandung NA dengan pengenceran 2 kali dan 8 well akan mengandung 0,078 mU/ml NA àbuat sejumlah variasi konsentrasi larutan standar NA untuk kurva kalibrasi.
  5. Tambahkan PNA-POD (peanut agglutinin-peroksidase) ke dalam tiap-tiap well. Peroksidase (sebagai konjugat) akan berikatan dengan galaktosa bebas (hasil reaksi neuraminidase-fetuin).
  6. TMB (Terta Metil Benzidine) digunakan sebagai kromofor untuk menunjukkan peroksidase yang terikat.
  7. Ukur Optical Density (OD) dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 450/620 nm.

Gambar 13. Skema prosedur pada larutan antigen standar

  1. 2. Penyiapan Larutan Sampel Antigen Virus

Alat:

- Plate ELISA

- Spektroskopi

Bahan:

- Larutan fetuin

- Larutan sampel antigen/virus: serum pasien

- Larutan dapar karbinat-bikarbonat 0,1 M pH 9,6

- Larutan dapar PBS pH 7,4 yang mengandung 0,5% Tween 20

- Konjugat PNA-POD (peanut agglutinin-peroksidase)

- Substrat kromogenik TMB (Terta Metil Benzidine)

Prosedur:

  1. Plate ELISA disensitisasi oleh antigen dengan penambahan 150 ml/well larutan fetuin konsentrasi akhir 50 µg/ml dalam larutan dapar karbonat-bikarbonat 0,1 M pH 9,6.
  2. Sebagian fetuin akan terabsorbsi sedang sebagian fetuin yang bebas dicuci hingga bersih dengan 350 µl dapar PBS pH 7,4 yang mengandung 0,5% Tween 20 sebangyak 6 kali.
  3. Masukkan serum pasien penerima dosis regimen oseltamivir fosfat (dengan konsentrasi yang semakin ke kanan, semakin rendah). Sebagian antibodi yang terdapat dalam serum akan berikatan dengan antigen (dalam hal ini fetuin). Neuraminidase (yang juga terdapat dalam serum) akan memotong residu galaktosa dengan memindahkan terminal asam sialat pada permukaan sel yang terinfeksi, sehingga akan diperoleh galaktosa dalam bentuk bebas.

Gambar 14. Struktur kimia asam sialat

Asam sialat merupakan turunan asam neuramik tersubstitusi pada N- atau O-, sebuah monosakarida dengan 9 atom C, disebut juga sebagai N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac atau NANA). Asam sialat kaya akan oligosakarida pada glyco terkonjugasi yang ditemukan pada permukaan membran.

  1. Antibodi yang berlebihan juga dcuci hingga bersih.
  2. Tambahkan PNA-POD (peanut agglutinin-peroksidase) ke dalam tiap-tiap well. Peroksidase (sebagai konjugat) akan berikatan dengan galaktosa bebas (hasil reaksi neuraminidase-fetuin).
  3. TMB (Terta Metil Benzidine) digunakan sebagai kromofor untuk menunjukkan peroksidase yang terikat.
  4. Ukur Optical Density (OD) dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 450/620 nm.
  5. Hasil yang seharusnya diperoleh jika oseltamivir memiliki aktivitas penghambatan neuraminidase (NAI) adalah penurunan OD dari serum pasien (OD lebih kecil) jika dibandingkan dengan larutan standar neuraminidase.

Catatan: Warna yang terbentuk berbanding terbalik dengan aktivitas obat (dalam hal ini antigen NA). makin banyak NA dalam sampel, makin banyak kesempatan untuk berinteraksi dengan fetuin yang terabsorbsi pada fase padat, sehingga lebih banyak konjugat enzim-hapten yang berinteraksi dengan kompleks hasil reaksi. Akibatnya, intensitas warna yang ditimbulkan juga makin kuat karena enzim yang berikatan dengan substrat juga makin banyak.

Gambar 15. Skema prosedur pada larutan antigen sampel (serum)

L. METODE UJI EID50, TCID50, dan CCID50

Embryo Infective Dose (EID), Tissue Culture Infectious Dose (TCID), Cell Culture Infectious Dose (CCID) dan Protection Dose (PD) merupakan uji-uji yang sangatlah penting dalam dunia kesehatan terutama dalam hal menyatakan derajat kematian dari suatu virus pada sel inangnya.

Penggunaan kultur jaringan bermanfaat dalam uji penentuan dosis infeksi virus yaitu Tissue Culture Infectious Dose (TCID50). Sementara itu, penggunaan embrio untuk penentuan dosis infeksi disebut dengan Embryo Infectious Dose (EID50). Penetapan nilai Cell Culture Infectious Dose 50% atau yang dikenal dengan sebutan CCID50 dapat digunakan untuk mengevaluasi potensi dari suatu vaksin yang dibuat, misalnya vaksin poliomyelitis atau vaksin mumps. Sementara itu, penentuan metode Protection Dose (PD50) akan berbeda-beda pada masing-masing kasus. Tergantung pada sel inang yang digunakan di dalam menyatakan derajat infeksi atau derajat kematian tersebut pun berbeda.

Pada uji biologis dikenal pula istilah dosis infeksi dan dosis yang mematikan. Istilah ini digunakan untuk menyatakan adanya efek yang ditimbulkan oleh virus, baik pada sel maupun jaringan dari sel inang yang peka (susceptible).

Perhitungan partikel virus dapat dilakukan secara fisika (dengan menggunakan mikroskop electron) atau berdasarkan pada konsep kimia (misalnya uji aglutinasi sel darah merah dengan uji HA).

  1. 1. Embryo Infectious Dose (EID50)

1.1.Teori Dasar

Infeksi diartikan sebagai suatu kesatuan yang meliputi : 1) masuknya bahan asing (agen ke dalam sel inang yang peka; 2) agen memperbanyak diri; 3) agen keluar dari sel pertama; 4) agen tersebut mengadakan invasi baru ke dalam sel yang lain/ sel berikutnya pada sel inang yang sama.

Pada saat agen berada dalam sel maka akan selalu terjadi gangguan/kerusakan fungsi sel tersebut. Apabila gangguan/kerusakan ini menyebabkan terjadinya perubahan fungsi fisiologis dari sel inang, maka kita menyatakan sel inang tersebut menderita sakit. Sakit selalu dimulai dengan adanya infeksi, akan tetapi tidak semua infeksi menyebabkan sakit, tetapi tergantung virulensi dari agen. Derajat infeksi atau derajat kematian ini dapat dihitung secara kuantitatif yang dikenal sebagai dosis infeksi atau dosis mematikan.

Tergantung pada sel inang yang digunakan untuk pengujian, maka satuan yang digunakan di dalam menyatakan derajat infeksi atau derajat kematian tersebut pun berbeda. Dengan demikian kita mengenal istilah Embryo Infective Dose (EID).

1.2.Cara Kerja

  1. a. Bahan dan Alat
    1. Vaksin virus aktif Lasota
    2. Larutan fisiologis Hank’s
    3. Antibiotik (Penisillin, Streptomisin)
    4. Telur Embryo Tertunas umur 9 hari, sebanyak 35 butir
    5. Tabung reaksi steril bertutup
    6. Alat suntik 1 ml
    7. Alat teropong telur
    8. Kapas, alcohol, kolodium
    9. Pipet 1 dan 5 ml
  1. b. Cara Kerja
    1. Siapkan larutan inokulum, yakni dengan menambahkan antibiotic penisilin sebanyak 10.000 IU dan larutan Streptomisin sebanyak 10.000μg untuk setiap 1 ml larutan Hank’s.
    2. Siapkan tabung reaksi steril sebanya 10 buah, beri nomor 1 s/d 10.
    3. Pipet larutan inokulum masing-masing 1,8 ml dari tabung 1 s/d 10.
    4. Pipet 0,2 ml vaksin virus aktif Latosa, masukkan pada tabung pertama.
    5. Lakukan homogenisasi dengan cara menghisap dan meniup atau dengan menggunakan alat mixer.
    6. Dengan menggunakan pipet 1 ml pindahkan 0,2 ml dari tabung pertama ke tabung kedua (ikuti metode no.5)
    7. Pindahkan 0,2 ml dari tabung kedua ke tabung ketiga. Lakukan hal yang sama hingga tabung nomor 9. Tabung nomor 10 adalah kontrol. Terjadi pengenceran kelipatan sepuluh, dapat dituliskan berturut-turut dari tabung pertama pengenceran sebagai berikut 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan seterusnya.
    8. Siapkan telur embrio tertunas untuk inokulasi.
    9. Lakukan penyuntikan ke dalam cairan alantoik dengan dosis 0,1 ml ke dalam masing-masing telur, sebanyak 5 butir telur, dimulai dari pengenceran 10-9, 10-8, sampai pengenceran 10-4.

10.  Telur tersebut kemudian dieramkan dalam inkubator dengan temperatur 37oC. Lakukan pengamatan setiap hari sampai hari keempat. Pada hari kelima semua telur dimasukkan ke dalam lemari es 4oC agar embrio mati.

11.  Lakukan uji aglutinasi cepat dari cairan alantois setiap telur pada gelas objek. Catat dan hitung hasil dengan menggunakan cara Reed dan Muench.

Gambar 16. Skema kerja penentuan Embryo Infectious Dose (EID50)

1.3.Perhitungan

  1. a. Perhitungan Dengan Menggunakan Cara Reed dan Muench

Untuk memudahkan pemahaman cara Reed dan Muench dalam menghitung hasil percobaan; tabel berikut dapat digunakan sebagai contoh.
Tabel 2. Contoh perhitungan ID50 menggunakan cara Reed dan Muench.

Log 10

(x)

Hasil individu hasil kumulatif rasio persentase
Positif Negatif Positif Negatif Total Positif Persen

(Y)

-4 5 0 21 0 21 21/21 100
-5 5 0 16 0 16 16/16 100
-6 5 0 11 0 11 11/11 100
-7 4 1 6 1 7 6/7 86
-8 2 3 2 4 6 2/6 33
-9 0 5 0 9 9 0/9 0

Dari tabel di atas, terlihat bahwa ID50 terletak di antara log pengenceran -7 dan log pengenceran -8. Untuk mendapatkan nilai yang sebenarnya, maka kita terlebih dahulu mencari nilai proporsi (Proportionate Distance = P. D.).

P.D. =   Persentase tepat di atas 50% – 50%

Persentase tepat di atas 50%- Persentase tepat di bawah 50%

Dengan demikian, nilai P.D. untuk contoh di atas didapatkan nilai sebagai berikut:

P.D. = 86-50 = 0,68

86-33

Nilai ini adalah nilai yang harus kita tambahkan dari log 10-7. Dengan demikian, maka log yang dapat menginfeksi 50% adalah:

ID50 = 10n/volume inokulum

n         = Log pengenceran tepat diatas 50% + p.d.

= 7 + 0,68

= 7,68

ID50 = 107,68/0,1 ml

Ini berarti, bila sediaan asal telah kita encerkan sebanyak 107,68 kali lalu kita suntikan pada hewan percobaan (dalam hal ini telur embrio) maka akan terjadi infeksi 50% dari jumlah hewan percobaan tersebut (nilai ID50 setiap 0,1 ml). Dengan perkataan lain, maka titer virus asal yang kita dapat adalah 107,68 ID50 setiap 0,1 ml atau 108,68 (dibulatkan 108,7 ID50 setiap 1 ml). Pernyataan titer di dalam 0,1 ml adalah volume inokulum, apabila inokulumnya dalah 0,2 ml maka nilai mililiter otomatis dikalikan dengan 5 atau dengan penambahan log 0,7. Jadi, misalnya contoh di atas digunakan inokulum 0,2 ml maka titernya adalah 107,68/0,2 ml atau 5 x 107,68 ID50/ml.

  1. b. Perhitungan Dengan Menggunakan Persamaan Garis

Tabel 3. Contoh perhitungan EID50 menggunakan persamaan garis.

Log 10

(x)

Hasil individu hasil kumulatif rasio persentase
Positif Negatif Positif Negatif Total Positif Persen

(Y)

-4 5 0 21 0 21 21/21 100
-5 5 0 16 0 16 16/16 100
-6 5 0 11 0 11 11/11 100
-7 4 1 6 1 7 6/7 86
-8 2 3 2 4 6 2/6 33
-9 0 5 0 9 9 0/9 0

y = a+bx

dimana  y = %terinfeksi

x = log konsetrasi

y   = 319,5 + 35,3 x    ; r = 0,979

50 = 319,5 + 35,3 x

35,3 x    = -269,5

x = -7,64

log konsentrasi = -7,64

maka EID50 = 107,64 EID50/0,2ml.

  1. c. Perhitungan Dengan Menggunakan Probit

Tabel 4. Contoh perhitungan EID50 menggunakan probit.

Log 10

(X)

Hasil Individu Hasil Kumulatif Rasio Persentase Konversi Persentase

(%)

Probit (Y)
Positif Negatif Positif Negatif Total Positif Persen
-4 5 0 21 0 21 21/21 100 95 6,64
-5 5 0 16 0 16 16/16 100 95 6,64
-6 5 0 11 0 11 11/11 100 95 6,64
-7 4 1 6 1 7 6/7 86 86 6,08
-8 2 3 2 4 6 2/6 33 33 4,56
-9 0 5 0 9 9 0/9 0 5 3,36

y = a+bx

dimana  y = probit

x = log konsetrasi

y   = 13,68 + 1,136 x  ; r = 0,986

5   =13,68 + 1,136 x

1,136 x = -8,68

x = -7,64

log konsentrasi = -7,64

maka EID50 = 107,64 EID50/0,2ml.

  1. 2. Tissue Culture Infectious Dose (TCID50)

2.1. Teori Dasar

Meskipun virus-virus telah banyak dikembangbiakan dalam kultur jaringan selama bertahun-tahun dan beberapa vaksin memang telah dihasilkan dari cara tersebut, namun baru pada akhir tahun 1940-an lah metode kultur jaringan tersebut menjadi banyak digunakan oleh para ahli virologi. Aplikasi luasnya dimulai dari penelitian yang dilakukan oleh Enders dan kawan-kawan pada tahun 1949 yang menyatakan bahwa virus poliomyelitis akan tumbuh pada jaringan nonsaraf manusia dengan cara kultur jaringan. Saat ini telah terbukti bahwa banyak virus manusia dapat siap tumbuh dalam semua sel yang berasl dari manusia dan juga dalma sel yang berasal dari monyet. Virus poliomyelitis adalah salah satu contoh virus yang akan tumbuh dalam sel-sel tertentu saja. Sebaliknya, ada pula beberapa virus yang dapat tumbuh dalam sel dari spesies-spesies yang berbeda. Misalnya, virus vaccinia dapat ditumbuhkan dalam kultur jaringan yang dibuat dari embrio ayam.

Bahan-bahan kultur jaringan yang digunakan dalam virologi bervariasi. Bahkan teknik kultur organ telah memberikan beberapa hasil yang menarik dalam studi mengenai hubungan antara sel inang-parasit dan tak diragukan lagi bahwa metode tersebut akan digunakan lebih luas lagi.

Kultur jaringan memiliki kemampuan untuk menyokong pertumbuhan virus dan menunjukkan keberadaan virus tersebut dengan terbentuknya lesi-lesi yang spesifik pada beberapa kasus. Kemampuan tersebut telah diaplikasikan dalam virologi untuk tiga tujuan, yaitu:

  1. Mempelajari hubungan antara sel inang-parasit
  2. Deteksi dan identifikasi virus-virus
  3. Produksi virus untuk industri vaksin

Isolasi, identifikasi dan titrasi dari virus patogen normal dilakukan dengan teknik-teknik standar. Tiga teknik yang paling penting meliputi titrasi sederhana, titrasi dengan pengaamatan pada inhibisi metabolik dan titrasi dengan teknik plaque Dulbecco.

2.2. Cara Kerja

  1. Isolasi Virus Poliomyelitis

1/10 suspensi feses dicampur dengan BSS dengan pengaduk gelas sampai potongan kecil larut

Sentrifugasi 3000 rpm selama 15-20 menit

Ambil supernatan jernih bebas bakteri (tambahkan antibiotik)

Masukkan 150.000 sel (HeLa atau ginjal monyet)/1ml media ke dalam botol roux

Inkubasi 37oC selama 1 jam

Media dipindahkan dan diganti dengan media yang baru

Inkubasi 37oC selama 1 jam

Diamati perubahan sipatogenik (bentuk, warna, ukuran, pertumbuhan, dll)

Gambar 17. Skema kerja isolasi virus poliomyelitis

Virus diisolasi dengan cara menyiapkan suspensi bebas bakteri dari sel yang telah terinfeksi virus. Sebagai contoh adalah isolasi virus poliomielitis dari feses. Suatu suspensi 1/10 dari spesimen feses disiapkan dengan cara mengaduknya di dalam BSS sampai semua gumpalan menghilang. Bagian padatnya kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi pada 3000 rpm atau lebih selama 15 hingga 20 menit. Supernatan yang jernih dipisahkan untuk diuji. Dengan persiapan yang hati-hati kemungkinan supernatan tersebut telah bebas bakteri namun utuk meminimalisasikan resiko kontaminasi, campuran antibiotik (penisilin, streptomisin, dan mikostatin) dapat ditambahkan.

Kultur dalam tabung untuk uji harus disiapkan agar berjumlah sekitar 15.000 sel (dari HeLa atau ginjal monyet) dalam 1 ml media. Setelah diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 jam, media dipindahkan dan digantikan dengan media segar yang baru. Spesimen tersebut diperiksa setiap hari untuk melihat apakah terjadi efek sitopatogenik umum.

Sebelum melanjutkan proses pemeriksaan serum untuk mengetahui keberadaan antibodi, diperlukan suatu titrasi virus untuk memperoleh dosis yang sesuai.

Mula-mula disiapkan 11 macam pengenceran virus dalam medium. Dari setiap pegenceran diambil 0,1 ml, ulangi sampai tabung ke-11, dimana pada tabung ini, 0,1 ml larutan dibuang. Kemudian ditambahkan ke dalam tabung uji yang berisi sekitar 150.000 sel dari galur tertentu. Setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam, media dipindahkan dan diganti dengan media yang baru. Kultur tersebut diperiksa ulang setelah beberapa hari untuk melihat adanya efek sitopatogenik. Pengenceran virus dimana setengah dari kultur dapat terinfeksi dikenal dengan sebutan TCID50 dan digunakan sebagai baku pada tahap selanjutnya.

  1. b. Titrasi Virus

Gambar 18. Skema kerja penentuan TCID50

2.3 PERHITUNGAN

a. Perhitungan Dengan Menggunakan Cara Reed dan Muench

Log Konsentrasi (x) Pengenceran Kultur terinfeksi Kultur tidak terinfeksi Jumlah terinfeksi Jumlah tidak  terinfeksi Fraksi terinfeksi Persentase terinfeksi (y)
-5 105 12 0 48 0 48/48 100
-6 106 12 0 36 0 36/36 100
-7 107 10 2 24 2 24/26 92.5
-8 108 8 4 14 6 14/20 70
-9 109 4 8 6 14 6/20 30
-10 1010 2 10 2 24 2/26 7.69
-11 1011 0 12 0 36 0/36 0

Tabel 5. Contoh perhitungan TCI50 menggunakan cara Reed dan Muench

Dari tabel percobaan di atas terlihat bahwa TCID50 treletak diantara log pengenceran 8 dan 9. Untuk mendapatkan nilai sebenarnya terlebih dahulu harus dicari nilai proporsif (P.D)

P.D      =                            Persentase tepat di atas 50% – 50%

Persentase tepat di atas 50% – Persentase tepat di bawah 50%

P.D      =          70 – 50                =       0.5

70 – 30

Nilai P.D ini ditambahkan pada pangkat pengenceran diatas 50% yaitu 8+0.5 menjadi 8.5, artinya bahwa virus poliomielitis pada pengenceran 108.5 kali bila disuntikkan pada kultur sel maka akan memberikan 50% infeksi (TCID50) dengna volime inukulum 0.1 ml

b. Perhitungan Dengan Menggunakan Persamaan Garis

Log Konsentrasi (x) Pengenceran Kultur terinfeksi Kultur tidak terinfeksi Jumlah terinfeksi Jumlah tidak  terinfeksi Fraksi terinfeksi Persentase terinfeksi (y)
-5 105 12 0 48 0 48/48 100
-6 106 12 0 36 0 36/36 100
-7 107 10 2 24 2 24/26 92.5
-8 108 8 4 14 6 14/20 70
-9 109 4 8 6 14 6/20 30
-10 1010 2 10 2 24 2/26 7.69
-11 1011 0 12 0 36 0/36 0

Didapatkan persamaan garis y= 242,96 + 22,69x

TCID50 yaitu pada 50% yang terinfeksi, jadi y = 50 maka x= -8.5

TCID50 = 108.5            TCID / 0,1 ml

Log Konsentrasi (x) Pengenceran Kultur terinfeksi Kultur tidak terinfeksi Jumlah terinfeksi Jumlah tidak  terinfeksi Fraksi terinfeksi Persentase terinfeksi Probit (y)
-5 105 12 0 48 0 48/48 100 7.05
-6 106 12 0 36 0 36/36 100 7.05
-7 107 10 2 24 2 24/26 92.5 6.48
-8 108 4 4 14 6 14/20 70 5.52
-9 109 8 8 6 14 6/20 30 4.48
-10 1010 10 10 2 24 2/26 7.69 3.59
-11 1011 12 12 0 36 0/36 0 2.95

Didapatkan persamaan Y = 12,34 + 0.86x

TCID50 yaitu pada 50% yang terinfeksi, jadi nilai probit/y = 5, maka x = -8.53

TCID 50 = 108.53 TCID50/0.1ml

3          Cell Culture Infections Dose (CCID50)

3.1 Teori dasar

Penetapan nilai Cell Culture Infections Dose 50%(CCID50) dapat digunakan untuk mengevaluasi potensi darisuatu vaksin yang dibuat, misalnya vaksin untuk polymielitis atau vaksin mumps.

Sebelum melakukan uji untuk menentukan nilai CCID50, hal yangperlu diketahui terlebih dahulu adalah sensitifitas dari sel sebab sensitifitas menunjukkan kemampuan dari suatau galur sek untuk mendeteksi adanya infeksi virus (misalnya dalam hal ini digunakan poliovirus). Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi sensitifitas tersebut mencakup kontaminasi Mycoplasma, kualitas dari media, kondisi pertumbuhan dan lain-lain. Perlu diingat pula bawa morfologi an karakteristik fisik lain bukan merupakan penenda yang baik untuk menilai sensitifitas dari suatu sel. Evaluasi untuk menilai sensitifitas dari suatu sel dilakukakn dengan menggunakan baku mengenai penyiapan virus yang telah dikarakterisasai denagn baik dari suatu titer yang telah dikenal dan reprodusibel.

Salah satu jenis virus yang dapat digunakan dalam uji CCID50 adalah virus galur Sabin. Penyiapan standar Sabin meliputi hal-hal berikut :

a. Lakukan pengenceran target titer dengan 5 lig 10/0.1 ml

b. Masukkan ke dalam vial-vial dan diberi label

c. Titer, srotip dan sekuens nukleotida ditentukan pada laboratorium                           analisis

d. Disimpan pada suhu -700C

Pada saat melakukan titrasi, parameter utama adalah interval antara pengenceran yang satu dengan lain serta jumlah replikasi sumuran yang dinokulasi (dimana direkomendasikan untuk membuat 10 sumuran untuk setiap pengenceran). Waktu pengenceran setelah inokualsi virus dan sbelum pembacaan hasil juga harus jelas. Pengenceran yang dipilih harus mampu meliputi 100% sampai 0% rentang respon dosis. Parameter yang telah disebutkan akan menentukan presisi dari uji ini.

Ada banyak emtode yang dapat digunakan untuk menentukan nilai CCID50. Salah satunya adalah sebagai berikut. Disiapkan 9 macam pengenceran medium 199 yang disertai dengan 2& serum fetus sapi (bovine fetal). Sel vero dicampur dengan penegnceran vaksin dan ditumbuhkan sedar oktaplicate (8 sumuran untuk setipa pengenceran) dalam 24 plat sumur. Plat tersebut kemudian diinkubasikan dalam 5% CO2 pada suhu 360C selama 10 hari. Uji ini dilakukan pada 5% serum dan 1×105 sel dalam setiap sumuran. Selama masa inkubasi, sel-sel tersebut diperikasa untuk melihat apakah terdapat perubahan sitopatik dan sumuran yang dinilai memberikan hasil positif dicatat.

Contoh lainnnya bisa denagn menggunakan pengenceran mulai dari 10-1 samapi 10-8. Mulai dari pengenceran 10-3 sampai 10-8, diambil 0.1 mmml inokulum untuk setiap pengenceran dimasukkan ke dalam 12 tabung dengan 2 tabung digunakan sebagai kontrol. Amati tabung mana saja yang memperlihatkan efek sitopatogenik.

3 2.      Cara Kerja

Suspensi virus yang berasal dari vaksin galur Sabin

0.1 ml     0.1 ml    0.1 ml     0.1 ml     0.1 ml     0.1 ml     0.1 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

(tiap tabung mengandung media 0.9 ml)

Masing-masing konsentrasi virus dimasukkan pada 12 sumuran, kemudian masing-masing ditambahkan 100.000 sel (tiap konsentrasi memiliki 2 buah kontrol)

Inkubasi 1 jam pada 37oC

Media dikeluarkan dari sel dan masukkan media baru

Inkubasi pada 37oC selama beberapa hari

Kultur diperiksa setelah beberapa hari

Apakah terjasi infeksi (dilihat daru perubahan sitopatogeniknya)

CCID50 terletak pada konsentrasi kultur yang setengahnya terinfeksi virus

Skema kerja penentuan CCID50

Log konsentrasi (x) Pengenceran Hasil individu Hasil kumulatif Ratio Persentase
Positif Negatif Positif Negatif Total Positif Negatif
-3 10-3 10 0 38 0 38 38/38 100
-4 10-4 9 1 28 1 29 28/29 96.5
-5 10-5 8 2 19 3 22 19/22 86.4
-6 10-6 7 3 11 6 17 11/17 64.7
-7 10-7 4 6 4 12 16 4/16 25
-8 10-8 0 10 0 22 22 0/22 0

3.3. Perhitungan

a. Perhitungan Dengan Menggunakan Cara Reed dan Muench

P.D.     =                       Persentase tepat di atas 50% – 50%

Persentase tepat di atas 50% – Persentase tepat di bawah 50%

P.D      =          64.7 – 50                      =          0.37

64.7 – 25

n       = log pengenceran tepat di atas 50% + P.D.

=  6 + 0.37       = 6.37

CCID50 = 10n / volume inokulum

= 106.37 CCID50 / 0.1 ml

b. Perhitungan Dengan Menggunakan Persamaan Garis

x  = log konsentrasi

Log konsentrasi (x) Pengenceran Hasil individu Hasil kumulatif Ratio Persentase
Positif Negatif Positif Negatif Total Positif Persen (y)
-3 10-3 10 0 38 0 38 38/38 100
-4 10-4 9 1 28 1 29 28/29 96.5
-5 10-5 8 2 19 3 22 19/22 86.4
-6 10-6 7 3 11 6 17 11/17 64.7
-7 10-7 4 6 4 12 16 4/16 25
-8 10-8 0 10 0 22 22 0/22 0

y = % terinfeksi

Dari tabel di atas diperoleh persamaan garis

y = 177.78 + 21.03 x

r = 0.95

CCID50 = terinfeksi 50% → y = 50

50        = 177.78 + 21.03 x

x        =  50 – 177.78 = -6.07

21.03

CCID50 = 106.07 CCID50 / 0.1 ml

c. Perhitungan Dengan Menggunakan Probit

Log Hasil Individu Hasil Kumulatif Fraksi %
Konsentrasi Pengenceran (+) (-) (+) (-) S Terinfeksi Terinfeksi
(x)
-3 103 10 0 38 0 38 38/38 100      97,5
-4 104 9 1 28 1 29 28/29 96,55
-5 105 8 2 19 3 22 19/22 86,36
-6 106 7 3 11 6 17 11/17 64,7
-7 107 4 6 4 12 16 4/16 25
-8 108 0 10 0 22 22 0/22 0     2,5

0% terinfeksi, 10 kultur/pengenceran (N) → 0.25 / 10 x 100 = 2.5%

100% terinfeksi, 10 kultur/pengenceran (N) → (10 – 0.25) / 10 x 100 = 97.5%

Log Hasil Individu Hasil Kumulatif Fraksi % Probit
Konsentrasi Pengenceran (+) (-) (+) (-) S Terinfeksi Terinfeksi (y)
(x)
-3 103 10 0 38 0 38 38/38 98 7,05
-4 104 9 1 28 1 29 28/29 96,55 6,88
-5 105 8 2 19 3 22 19/22 86,36 6,08
-6 106 7 3 11 6 17 11/17 64,7 5,39
-7 107 4 6 4 12 16 4/16 25 4,33
-8 108 0 10 0 22 22 0/22 2,5 3,12

y = a + bx

dimana y = probit

x = log konsentrasi

Dari persamaan regresi, diperoleh :

a = 9.87342

b = 0.79971     y = 9.87342 + 0.79971x

r = 0.97867

Probit = 5 → 50% terinfeksi = CCID50

y   = 5 →              5          = 9.87342 + 0.79971x

0.79971x      = -4.87342

x          = -6.09398 = -6.09

CCID50 = 106.09 CCID50 / 0.1 ml

= 107.09 CCID50 / ml

v     Protection Dose (PD50)

Penetapan nilai Protection Dose 50%/PD50 dapat digunakan untuk menetapkan potensi dari suatu vaksin yang dibuat.

Prosedur yang dilakukan  pada Uji Protection Dose (PD50) memiliki kemiripan dalam hal prinsip denagn penetapan angka KHM (Kadar Hambat Minimum) suatu antibiotik. Dalam hal ini PD50 digunakan sebagai nilai pada pengenceran berapa suatu vaksin dapat menghambat pertumbuhan dari virus.

Namun, ada hal yang menyebabkan prosedur uji Protection Dose (PD50) sulit untuk ditetapkan, yaitu prosedur uji dari tiap vaksin untuk jnis penyakit tertentu berbeda-beda tergantung pada jenis/galur dari virus tersebut.

Daftar Pustaka

(Disarikan dari CDC: Key Facts About Avian Influenza (Bird Flu) and Avian Influenza A (H5N1) Virus)

http://www.biotec.com/FullDetails.asp?product_id=186

http://www.virology.ws/2009/05/27/influenza-hemagglutination-inhibition-assay/

www.avianinfluenza.org/mutated-avian-influenza-virus-h5n1.php

http://www.sumbarprov.go.id/home/detail.asp?iData=318&iCat=379&iChannel=32&nChannel=Artikel

http://www.sehatgroup.web.id/articles/isiArt.asp?artID=9

http://wrm-indonesia.org/content,view/462/90/

About these ads

4 thoughts on “Flu Burung

  1. thx iyah mb…blogmu dah bantu aq bgdd..
    klo laen x aq tny about AI lg leh kn??sle skripsiqu antivirus AI..bantu aq ya ce…
    makasih

  2. mb…aq mau tnya ney.

    klo pd uji HA tu kan pke cara hitungnya pke yg 2 pangkat n….
    aq dtanya pembimbingku,knp pke angka 2..pustaka yg menjelaskan itu da g??pa??aq cari2 g nemu…mb tau g, puataka yg menjelaskan ttg tu…
    mksih

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s